miRNA是一种由长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,现已证明miRNA与多种肿瘤的形成有关,控制和抑制miRNA的形成可以降低肿瘤的形成,但miRNA在细胞内的表达量很少,目前miRNA在肿瘤内的作用机制尚不完全清楚。本研究通过两种方法构建癌症病人血浆外泌体miRNA cDNA文库模板,探究影响RT-qPCR反应体系扩增效率的因素。通过在miRNA的3’端和5’端连接适配子和在3’端进行PolyA和5’端连接适配子进行模板构建,通过RT-qPCR分析扩增效率,用酶切法和磁珠分离法去除扩增中非特异性扩增。主要实验结果如下:在miRNA稳定性实验中,将miRNA储存在不同温度,pH和时间条件下,通过RT-qPCR反应得到Ct值,通过标准曲线定量计算miRNA浓度,通过对不同影响因素进行定量分析后优化最佳储存条件,短时间储存可以在4℃,长时间储存在-80℃,储存缓冲液为中性。在模板构建实验中,第一种方法在miRNA的3’端和5’端分别连接一段适配子,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证模板构建成功,并进行RT-qPCR实验,实验结果出现非特异性扩增曲线。第二种方法在3’端PolyA,在5‘端连接一段适配子,变形聚丙烯酰胺凝胶电泳验证模板构建成功,qPCR实验结果出现非特异性扩增曲线。两种方法由于非特异性扩增扩增效率较低。在非特异性扩增去除实验中,非特异性扩增来源于5’端未连接的适配子,通过phi29DNA聚合酶,核算外切酶T(EXOT酶)和磁珠分离去除5’端过量适配子,phi29DNA聚合酶和核算外切酶T降解效率和特异性低,9%PEG磁珠缓冲液沉淀大片段,15%PEG磁珠缓冲液沉淀目标片段,磁珠分离效率较高。在细胞和癌症病人血浆外泌体验证实验中,成功构建293T细胞总RNA和癌症病人血浆外泌体miRNA的RT-qPCR反应模板。