高血压可引起以血管和组织间隙纤维化为特征的心肌损伤,进而造成心肌组织硬化和心力衰竭发生。已知有多种因素,包括炎性细胞因子、氧化应激因子及血管内皮功能失常等,均参与高血压诱导的心肌纤维化发生。目前临床上针对这些机制的治疗方案,虽能延缓高血压患者心肌纤维化的进程,但最终的临床治疗效果尚未令人满意。这提示在高血压所致心肌纤维化的发生、发展过程中,可能有未知因素参与其中。因此,进一步澄清高血压引发心肌纤维化形成机制,有助于改善心力衰竭患者的治疗和临床预后。大量基础研究和临床观察证实肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)在调控心血管系统的生理过程中承担重要角色,其中血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)为RAS系统主要成分,它与1型Ang II受体(angiotensin II type 1 receptor,AT1)相结合,可引起血管收缩、全身性炎症反应、巨噬细胞及成纤维细胞聚集、组织间隙胶原沉积等,最终导致高血压、心肌肥厚和纤维化。然而,近年来发现的血管紧张素转换酶同源物-血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)可将Ang II转化为Ang(1-7),后者产生与Ang II相反的生理学效应,即对抗心肌纤维化、增生和炎性反应的作用。此外,Ang(1-7)可激活血管内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS),生成一氧化氮,引起全身性血管扩张,减轻心脏前、后负荷及心肌纤维化。但目前尚不清楚ACE2和e NOS是否共同参与Ang II引起的高血压和心肌肥厚的变化?阻断AT1受体能否调控ACE2及e NOS表达,进而影响Ang II诱发的血压升高和心肌肥厚?以胶原蛋白为主的细胞外基质在血管周围和组织细胞间的异常沉积是纤维化主要特征。近年来发现,除胶原蛋白外,透明质酸(hyaluronic acid,HA)的聚积也被认为是组织纤维化发展的特征之一。HA在透明质酸酶(hyaluronidase,Hyal)作用下降解为低分子量片断透明质酸(low molecular weight,LMW-HA),它与细胞膜表面特异性受体CD44结合,调控细胞生长、细胞与细胞外基质粘附、粘附蛋白的表达和炎症反应。大量研究发现,CD44-HA间的相互作用,可加速肺脏、肝脏、肾脏组织纤维化病理进程。但这种相互作用是否也参与Ang II诱导的心肌组织纤维化病理过程,目前仍不清楚。综上所述,我们推测ACE2、e NOS以及CD44-HA间的相互作用,可能与Ang II所致血压升高和心肌纤维化的病理过程有关,故本研究假说与研究内容如下:1.观察Ang II是否通过AT1受体,进而调节ACE2活性及e NOS的表达来发挥升高血压的作用。2.探讨Ang II引起心肌纤维化的作用是否和CD44相关,这些作用是否通过AT1受体实现。3.在细胞水平,直接观察Ang II活化的细胞增殖通路,包括TGF-β1、p Smad2、Smad4、Collagen I是否与CD44表达相关。第一部分:阻断1型血管紧张素II受体通过改变ACE2/e NOS活性,抑制Ang II致血压升高及心肌肥厚研究目的:观察Ang II升高血压的现象,揭示ACE2、e NOS在Ang II诱发血压升高和心肌肥厚病理过程中与AT1受体的关系。实验方法和分组:1.健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只,皮下植入Alzet微量渗透压泵。随机分为6组,分别为观察期2周及4周的假手术组(Sham)、Ang II输注组(Ang II)及Telmisartan干预组(Telmi):(1)假手术组(Sham):微量渗透压泵持续输注生理盐水,同时予以AT1受体阻断剂Telmisartan(Telmi)胃饲,10 mg/kg/day,每日1次;(2)Ang II输注组(Ang II):微量渗透压泵以500 ng/kg/min持续输注Ang II;(3)Telmi干预组(Telmi):微量渗透压泵以500 ng/kg/min持续输注Ang II,同时予以Telmi胃饲,10 mg/kg/day,每日1次。2.采用ML125无创血压测量系统,于实验第0、7、14、28天,分别在清醒状态测量观察期4周的大鼠尾动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP),计算平均动脉压。3.观察期结束后取材,计算心脏质量/体重(HW/BW)比值,经苏木精-伊红(hematoxylin eosin staining,HE)染色,分别观察心脏大小、心肌细胞横截面积的变化。4.荧光酶标仪测定心肌组织ACE2活性。5.采用免疫组织化学染色法观察AT1、AT2、ACE2、e NOS蛋白在心肌组织及血管的原位表达,并通过Western blot进行定量分析。实验结果:1.Ang II输注期间,大鼠血压持续升高,于观察期第28天平均动脉压可达假手术组的2.26倍。同期予以Telmi干预则可明显降低血压,甚至低于基础血压。在假手术组,Telmi对血压则无影响。2.心肌组织HE染色结果发现,Ang II输注2周心肌细胞出现肥大,4周时心肌细胞肥大显著,与HW/BW所提示心室肥厚相一致,Telmi完全逆转Ang II引发的心肌组织病理改变。3.免疫组织化学染色及Western blot结果提示,Ang II使心肌组织AT1、AT2受体发生反向调节,即上调AT1受体表达,下调AT2受体表达;同时ACE2活性下降,达40%左右,它和e NOS蛋白表达也明显下降。同期予以Telmi干预则可逆转上述变化。小结:阻断1型Ang II受体,能够下调组织AT1/AT2受体比例,增强组织ACE2活性及血管e NOS蛋白的表达,抑制Ang II诱导的血压升高及心肌细胞肥大、心室肥厚的病理改变。第二部分:阻断1型血管紧张素II受体通过改变CD44-透明质酸相互作用,改善Ang II所致心肌纤维化研究目的:探讨CD44-HA相互作用对Ang II诱导心肌纤维化病理过程的影响及其与AT1受体的关系,揭示心肌纤维化发展过程可能存在的新机理。实验分组和方法:1.大鼠心肌纤维化模型的制备、分组及取材与第一部分研究内容相同。2.采用免疫组织化学染色及Western blot定性与定量检测心肌组织CD44表达。3.明胶酶谱法测定透明质酸酶活性。4.通过免疫组织化学染色及Masson’s三色染色原位观察心肌组织单核-巨噬细胞浸润,肌成纤维细胞增殖及心肌组织病理学改变。5.Western blot定量检测心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、Collagen I蛋白水平的变化。实验结果:1.免疫组织化学染色、Western blot及明胶酶谱结果显示,在持续输注Ang II期间,CD44蛋白表达水平上调,透明质酸酶活性明显升高。Telmi干预可下调CD44表达及透明质酸酶活性。2.Ang II输注2周,单核细胞在血管管腔内大量积聚;Ang II输注4周,单核细胞渗入组织间隙转化为巨噬细胞,同时心肌细胞间质中肌成纤维细胞明显增多。同期予以Telmi干预,可逆转单核-巨噬细胞聚积,并减少细胞间质肌成纤维细胞数量。3.Ang II输注4周,TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达上调,Smad7蛋白表达下调。Telmi阻断AT1受体后,逆转心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达。4.Masson’s三色染色及Western blot结果显示:Ang II输注2周,心肌纤维化即开始发生,4周时出现明显的组织纤维化病理学改变,心肌组织Collagen I蛋白表达明显增加,Telmi干预改善心肌组织纤维化。小结:阻断Ang II与AT1受体特异性结合,下调CD44表达,降低透明质酸酶活性并减少单核-巨噬细胞渗出及肌成纤维细胞增殖。这些结果提示,CD44-HA相互作用可能参与Ang II诱导的心肌组织血管纤维化病理过程。第三部分:阻断1型血管紧张素II受体,下调乳鼠心脏成纤维细胞CD44表达并抑制增殖传导通路研究目的:直接证实Ang II活化的细胞增殖通路,包括TGF-β1、p Smad2、Smad4、Collagen I与CD44的表达是否相关及其与AT1受体的关系。实验分组和方法:1.采用差速贴壁法,分离培养原代大鼠乳鼠心脏成纤维细胞,并利用细胞免疫荧光法进行鉴定。2.细胞计数Kit-8法(CCK8)观察不同浓度Ang II对心脏成纤维细胞的增殖作用。3.在给定Ang II浓度及联合应用AT1受体阻断剂Telmi刺激心脏成纤维细胞时,采用Western blot与实时荧光定量PCR法检测心脏成纤维细胞CD44、TGF-β1、p Smad2、Smad4、Collagen I蛋白表达的变化。实验分组:对照组(无Ang II刺激);Ang II组(Ang II 50n M);Telmi组(Ang II 50n M+Telmi 100n M)。实验结果:1.差速贴壁法分离的心脏成纤维细胞,经细胞免疫荧光鉴定显示Vimentin和DDR2为阳性,所得细胞纯度达95%以上。2.CCK8结果显示Ang II对心脏成纤维细胞有增殖作用,且这一效应在50n M时最明显。3.Western blot与实时荧光定量PCR结果显示,以50 n M Ang II刺激心脏成纤维细胞,CD44蛋白及m RNA表达明显增加,与TGF-β1、p Smad2、Smad4、Collagen I蛋白表达上升相一致。Telmi阻断AT1受体后,则完全逆转上述蛋白的表达。小结:特异性阻断1型Ang II受体,可降低Ang II介导的心脏成纤维细胞CD44蛋白表达增加,并抑制与纤维化及细胞增殖相关的胶原蛋白产生和释放。本研究展望上述研究表明,阻断AT1受体,能够下调AT1/AT2受体比例、增加ACE2活性及e NOS蛋白表达,逆转Ang II诱导的血压升高;此外阻断AT1受体,心肌组织CD44表达下调,透明质酸酶活性降低,抑制TGF-β1/Smads/Collagen纤维化通路,首次证实了Ang II所致心肌纤维化的新机制。这些结果为进一步寻找对抗Ang II导致血压升高和心肌纤维化的药物研发(i.e.,通过选择性激活ACE2或抑制Hayl活性)提供了实验依据,与目前其他药物治疗相结合,可能为心肌纤维化患者提供治疗的新思路。