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乳腺癌作为一种高危害的恶性肿瘤,是造成女性死亡的重要疾病之一。全球范围内乳腺癌的发病和死亡人数逐年递增,引起了人类的广泛关注。虽然乳腺癌最有效的治疗手段仍是外科手术治疗,但晚期乳腺癌或者手术后复发的患者数量仍然居高不下,对这部分患者的治疗亟待更有效的进展。随着科学家们对乳腺癌的研究越来越深入,取得了一系列重要的研究成果,这些研究成果中已经有部分应用到临床治疗工作中,并且取得了一定的治疗效果。近年来,特别是疾病的诊断和治疗进入分子时代后,医生根据更加详细的乳腺癌分子分型制定不同的治疗方案,取得了较好的治疗效果。同时,治疗乳腺癌的新药开发也取得了长足的进步,在这些新药中不乏一些明星药物,比如:曲妥珠单抗、哌柏西利、奥拉帕利等。细胞周期依赖性蛋白激酶4/6（Cyclin-dependent protein kinase,CDK4/6）抑制剂是近年来投入乳腺癌临床治疗的新药之一,该类药物的使用初期取得了较好的治疗效果,但随着长期和广泛的使用,不可避免的出现了众多先天性或后天获得性耐药患者。CDK4/6抑制剂耐药患者数量的积累,大大限制了该药物的应用,造成了极大的健康和经济负担。因此,关于CDK4/6抑制剂治疗乳腺癌产生耐药的相关研究有着重要意义,也是乳腺癌研究的重要方向之一。本研究利用多组对CDK4/6抑制剂耐药和敏感的乳腺癌细胞转录组数据进行差异分析,将多个数据集的差异基因进行交叉重叠,初步筛选了待研究的靶基因。利用了对CDK4/6抑制剂耐药的MCF7和ZR75-1细胞系,采用实时荧光定量PCR实验在敏感和耐药细胞中验证候选基因的表达水平,初步确定了卵黄样羧肽酶（Carboxypeptidase vitellogenic like,CPVL）可能是调控乳腺癌细胞对CDK4/6抑制剂耐药的关键因子。在体外细胞实验中,我们验证了过表达CPVL能够促进乳腺癌耐药细胞在CDK4/6抑制剂作用下的存活和克隆形成能力。由于CDK4/6抑制剂杀伤肿瘤细胞的作用机制是阻滞细胞周期进程,我们接下来通过细胞周期实验,验证了过表达或者敲低CPVL能够促进或者抑制耐药细胞由G1期向S期进展。在此基础上,我们还采用了细胞凋亡检测实验证明了过表达或敲低CPVL能够抑制或者促进耐药细胞的凋亡。这些结果证明CPVL可能参与调控乳腺癌细胞对CDK4/6抑制剂的耐受能力。为进一步确定CPVL调控乳腺癌细胞对CDK4/6抑制剂耐受的分子机制,我们下载了癌症基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）数据库中乳腺癌患者转录组数据集,通过基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）发现乳腺癌组织中CPVL的表达水平可能与磷酸酯酶与张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog,PTEN）信号通路相关。通过蛋白质免疫印迹实验证明了CPVL能够负调控PTEN蛋白及其下游细胞周期相关蛋白的表达。通过CCK-8检测细胞活性实验和平板克隆形成实验发现CPVL通过调控PTEN蛋白促进乳腺癌细胞对CDK4/6抑制剂耐药。细胞周期和凋亡检测实验同样证明了CPVL通过调控PTEN蛋白影响耐药细胞周期进程和凋亡。综上,我们发现CPVL是通过调控PTEN蛋白促进乳腺癌细胞对CDK4/6抑制剂耐药。接下来,我们还研究了乳腺癌耐药细胞中CPVL被调控的分子机制。首先通过生物信息学网站预测了可能与CPVL启动子区结合的转录因子,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验证明了转录因子CCAAT增强子结合蛋白β（CCAAT enhancer binding protein beta,CEBPB）可能激活CPVL的转录,结合生物信息学预测方法和体外细胞学实验证明了CEBPB与CPVL启动子区结合的位点。由于脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid,DNA）的甲基化修饰水平通过各种机制影响基因表达水平,我们在接下来的研究中关注了CPVL启动子区是否存在甲基化修饰。通过分析序列特征预测了该启动子区可能存在甲基化岛,重要的是,CEBPB与CPVL启动子结合的区域正好位于该甲基化岛范围内。染色质免疫共沉淀实验和甲基化特异性PCR实验证明了胸腺嘧啶DNA糖基化酶（Thymine DNA glycosylase,TDG）负调控CPVL启动子区甲基化岛的甲基化修饰水平。细胞学实验证明了TDG能够以依赖CEBPB的条件促进CPVL的转录,上调乳腺癌耐药细胞对CDK4/6抑制剂的耐受能力。小鼠皮下成瘤实验证明了CPVL/PTEN轴在体内调节乳腺癌对CDK4/6抑制剂的耐药。结果显示,敲低CPVL能够抑制小鼠皮下肿瘤的生长,而PTEN抑制剂的加入抵消了敲低CPVL的抑瘤作用,证明了在小鼠体内CPVL同样能够通过抑制PTEN促进肿瘤增殖。总之,在乳腺癌耐药细胞中我们发现了CPVL/PTEN轴调控CDK4/6抑制剂耐药这一分子机制,为探索解决CDK4/6抑制剂治疗乳腺癌过程中产生的耐药问题提供了新的思路和策略。