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目的通过体外调节肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的自噬水平,观察血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF-α)在不同自噬状态下HSC的增殖、凋亡及胶原生成的调节作用,以及通过对特异性阻断自噬信号通路的研究,了解自噬现象对细胞增殖、凋亡的影响,为抗肝纤维化治疗提供新的理论依据。方法1. Western-blot技术检测原代培养大鼠HSC中自噬信号分子蛋白的表达；2.透射电镜观察自噬促进剂及抑制剂作用下HSC超微结构的变化；3.细胞免疫荧光技术观察不同自噬水平HSC微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein1light chain3, LC-3B)的表达；4.MTT检测PDGF对不同自噬水平下HSC增殖的影响；5.倒置显微镜观察药物作用后HSC形态学变化；6.流式细胞术检测TNF-α对不同自噬水平下HSC凋亡的影响；7. Real-time PCR检测不同自噬水平下PDGF、TNF-α对肝星状细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响；8.应用siRNA技术特异性阻断自噬信号通路后,观察PDGF、TNF-α作用下肝星状细胞增殖、凋亡及Ⅰ型前胶原mRNA的表达,分析自噬和HSC增殖、凋亡、胶原生成之间的关系。结果1. Western-blot、透射电镜、细胞免疫荧光技术中均观察到,自噬促进剂雷帕霉素(Rapamycin)作用下,HSC的自噬特异性标志蛋白LC-3B表达增加；相反,自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methladenine,3-MA)作用下LC-3B的表达明显减少。此外,在羟氯喹(hydroxychloroquine, HCQ)作用下,肝星状细胞内LC-3B及自噬溶酶体的表达显著增加。2.MTT及倒置显微镜观察均提示,单独PDGF及PDGF联合Rapa作用于HSC后,细胞增殖不明显；而PDGF分别联合3-MA、HCQ作用后,HSC增殖明显得到抑制,且可见细胞明显皱缩。同样,在特异性阻断自噬通路后,HSC增殖明显得到抑制。3. PDGF作用下,HSCI型前胶原mRNA表达与对照组无明显差别,而PDGF分别联合3-MA与HCQ则可下调I型前胶原mRNA的表达；相反,PDGF联合Rapamycin作用则可上调HSC Ⅰ型前胶原mRNA的表达。但PDGF对HSC的刺激作用在Beclinl siRNA及Atg5siRNA特异性阻断自噬信号通路的情况下,HSC的Ⅰ型前胶原mRNA的表达无明显变化。4.TNF-α作用下HSC凋亡较对照组增多,而TNF-α分别联合HCQ及3-MA则可使HSC凋亡进一步增加；相反地,TNF-α联合Rapamycin则可逆转这一现象。5. TNF-α可抑制HSCI型前胶原mRNA的表达,TNF-α分别联合3-MA与HCQ则可使HSCI型前胶原mRNA的表达显著下降；然而,TNF-α联合Rapamycin可使HSCI型前胶原mRNA的表达增加；但是,在Beclinl siRNA、Atg5siRNA特异性阻断自噬信号通路的情况下,TNF-α对HSCI型前胶原mRNA的作用不明显。6. TNF-α可促进人HSC-LX2凋亡蛋白酶(caspase-3)的表达,而异性si-RNA则可抑制人HSC-LX2自噬蛋白Beclinl、ATG5的表达,TNF-α联合特异性si-RNA则可通过促进caspase-3的前体向磷酸化转化,从而促进HSC的凋亡。结论(1)、再次证实HSC中存在自噬现象。(2)、促进HSC白噬,细胞增殖、凋亡水平变化不明显。(3)、抑制HSC自噬,细胞的增殖水平下降,细胞的凋亡水平升高。(4)、特异性抑制HSC自噬水平,Ⅰ型前胶原mRNA的表达有下降趋势,但因转染效率关系,暂无统计学差异结果。