疟疾是一种在世界范围内广泛传播的原虫性疾病,严重危害人类健康。在过去的20年里,疟疾的防控取得了历史性进展,但疟疾仍然是重大的公共卫生问题。尤其是近年来按蚊对杀虫剂抗性的不断增强以及青蒿素耐药虫株的传播,使得疟疾疫苗的研制更为迫切。现有疟疾疫苗候选抗原多为采用血清学筛选的方法获得的高免疫原性蛋白质,但以这些抗原为基础制备的疟疾疫苗,临床保护性效果欠佳。强有力的疟疾疫苗的研发,需要对疟原虫抗原的免疫原性进行进一步的研究,发掘具有良好保护性效果的疫苗候选抗原。恶性疟原虫裂殖子入侵红细胞是其生长发育的关键步骤,而疟原虫的入侵需要依赖于入侵相关蛋白质,并且裂殖子表面蛋白质是红细胞内期虫体直接暴露于宿主循环的抗原,因此裂殖子入侵关键蛋白是疟疾红内期疫苗候选抗原的良好靶标。课题组前期对恶性疟原虫已知的入侵关键蛋白质的B细胞线性表位进行了筛查,大规模多肽微阵列芯片检测结果显示,高抗原性表位多为高重复性和/或低复杂性序列,这些序列多高度保守,并且定位于非功能性结构域,提示疟原虫可能利用这些高免疫原性表位吸引宿主体液免疫反应,从而保护其功能性位点。以往依赖于血清学的检测方法发现的高抗原性疟原虫蛋白质可能并非疟疾疫苗的良好靶点。疟疾疫苗候选抗原的筛选应聚焦于其功能。基于上述发现,课题首先针对这些高免疫原性表位进行了体外实验,将来自14个入侵关键蛋白质的20个包含高抗原性表位的多肽作为免疫原制备相应的多克隆抗体,将这些加入疟原虫培养体系,检测疟原虫增殖情况,验证这些表位在疟原虫入侵和生长发育中的作用。研究发现大部分针对高免疫原性表位的抗体并不能有效阻断疟原虫的入侵,而针对疟原虫蛋白质功能靶点的多抗(如包含入侵关键蛋白质MESA的红细胞结合位点多肽的抗体)能够显著抑制疟原虫的增殖。上述实验证实恶性疟高抗原性表位诱发的体液免疫并不能真正起到保护作用,可能帮助疟原虫逃避免疫系统的清除;而针对疟原虫低抗原性功能位点的抗体可能更适合作为疟疾疫苗的候选抗原。为了深入发掘新型疟原虫关键功能蛋白质,特别是裂殖子入侵蛋白质,本课题前期已完成恶性疟原虫实验室标准株PF3D7全部染色体基因在不同生长发育阶段的精准转录组检测。14号染色体是恶性疟原虫14条染色体中唯一不含有此变异抗原基因的染色体,也是基因含量最多的一条染色体。本课题依托课题组前期工作——恶性疟原虫PF3D7株第14号染色体全部801个基因的转录规律进行分析,发现了 87个在裂殖子入侵过程中特异性高表达的基因,其中64个为未知基因,我们将这些基因进行序列扩增及克隆构建,共成功制备13个重组蛋白质,并制备了相应的多克隆抗体,深入研究这些裂殖子新型蛋白的表达规律及其功能。结果发现大部分蛋白在终末期裂殖体至裂殖子时期有表达,PfMP-4、PfMP-7和PfMP-9基因编码蛋白的多克隆抗体能有效干扰虫体增殖,其余蛋白的多克隆抗体对虫体增殖也有一定的抑制效果。免疫荧光实验发现发现PfMP-4、PfMP-5、PfMP-6、PfMP-9、PfMP-10和PfMP-11基因编码蛋白在裂殖子时期表达量较高,且与已知的裂殖子表面蛋白1(MSP1)定位相似,表达于膜表面。综上所述,本课题揭示了疟疾高抗原性表位在疟原虫免疫逃逸中发挥的作用;提出了疟疾疫苗筛选不应以免疫原性为唯一标准,而应注重疟原虫蛋白质功能性;摒弃了传统的血清学方法而采用了精准转录组学研究,并发现了三个有可能在疟原虫入侵红细胞阶段发挥重要作用的新型裂殖子蛋白,为恶性疟新型治疗方案的建立或新型疫苗的设计提供了有价值的靶标和理论依据。