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视网膜色素变性（retinitis pigmentosa,RP）是一种遗传性视网膜变性（retinal degeneration,rd）疾病,以渐进性视杆和视锥细胞变性为特征,导致夜盲、视野缺损,甚至全盲,其全球范围内患病率约为1/4000。RP具有高度遗传异质性,目前已知有100余种致病基因以及3000余种突变位点与其相关。RP大多局限于眼部（nonsyndromic RP）,如伴发非眼部病变则被称为综合征型RP（syndromic RP）,其中最常见的为伴发耳聋的Usher综合征（Usher syndrome,USH）,其致病基因同样具有遗传异质性,均为常染色体隐性遗传。USH是遗传性耳聋-失明最常见的的病因,根据其临床表现可分为三型,最常见的为II型（Type II USH,USH2）,表现为RP和非进行性听力下降。RP和USH的临床表现十分复杂,相关基因的功能还有许多未知之处,并且尚无有效的治疗方法。因此,对发病机制和治疗方法的研究主要依赖于相应的模式动物,其中最常见是小鼠。RP小鼠种类较多,相关研究已经取得了一定进展,但USH小鼠大多都无明显眼部表现,与患者的临床表现不同,这也给USH的研究带来了一定阻碍。我实验室利用视觉电生理的检测手段,筛查出几种昆明小鼠（Mus musculus Kun Ming,KM）来源的自发性遗传性视网膜色素变性小鼠。在进行基因初步筛查时我们发现其中有一个品系Pde6b和Ush2a基因表达显著下降,将其暂命名为KMush/ush,目前已近交至F27代;另外一个品系仅表现为Pde6b表达下降,暂命名为rd/KM,目前已近交至F33代,同时,我们将其和C57/BL6J小鼠杂交并建成同源导入近交系,暂命名为rd/B6,目前也已近交至F25代。本研究在对KMush/ush小鼠的表型和基因型进行检测后,为了明确其致病基因的遗传特点以及进一步的基因检测,我实验室引入了具有听力“金标准”的CBA/Ca J小鼠,将其和KMush/ush小鼠进行杂交,拟将致病基因导入CBA/Ca J小鼠中。本研究基于KMush/ush、rd/KM和rd/B6小鼠,对其发育表型及致病基因进行研究,并建立和分析KMush/ush和CBA/Ca J小鼠杂交家系。【目的】研究KMush/ush、rd/KM和rd/B6小鼠发育过程中的视觉和听觉功能、形态等表型的变化,确定其致病基因位点,并对KMush/ush和CBA/Ca J小鼠杂交家系进行分析,明确致病基因的遗传特点。【方法】第一部分:KMush/ush小鼠的表型特征和致病基因检测随机选取出生后第7天（Postnatal day 7,P7）至P56的KMush/ush小鼠,以同龄野生型昆明小鼠作为对照。于P14、P21和P56进行视网膜电图（electroretinogram,ERG）和听觉脑干诱发电位（auditory brainstem response,ABR）检测。记录ERG暗视0.01cd.s.m-2反应、暗视3.0 cd.s.m-2反应、暗视3.0 cd.s.m-2 OPs反应、明视3.0 cd.s.m-2反应和明视3.0 cd.s.m-2 Flicker反应的幅值以及ABR阈值。于P21行眼底照相,P7、P14、P21和P56进行视网膜组织石蜡切片和H E染色。于P7、P14、P21、P28和P56进行Pde6b和Ush2a m RNA表达量的检测,并在P56时对Pde6b和Ush2a基因外显子进行测序。第二部分:KMush/ush小鼠与CBA/Ca J小鼠杂交家系的筛查与分析利用ERG和ABR对CBA/Ca J小鼠进行检测,确定其视觉和听觉功能良好,随后随机选取两只CBA/Ca J雌鼠与一只雄性KMush/ush小鼠进行杂交,余下的CBA/Ca J小鼠继续交配繁殖。杂交F1代于P30时经过ERG和ABR筛查后进行兄妹交配,所生的F2代采用同样方法于P30进行筛查。记录ERG暗视3.0 cd.s.m-2反应b波幅值和ABR阈值。第三部分:KMush/ush小鼠与CBA/Ca J小鼠杂交F3代表型及基因表达检测将第二部分实验中筛查出的具有阳性表型的小鼠分别进行兄妹间交配,所生的杂交F3代小鼠于P30时行ERG、ABR、视网膜光学相干断层扫描（optical coherence tomography,OCT）检测,并记录ERG暗视3.0 cd.s.m-2反应b波幅值、ABR阈值和外核层（outer nuclear layer,ONL）厚度,同时利用实时荧光定量PCR的方法检测杂交F3代小鼠Pde6b和Ush2a m RNA表达量。第四部分:rd/KM小鼠和rd/B6小鼠的视网膜功能、形态改变和致病基因测序随机选取P14至P56的rd/KM和rd/B6小鼠,分别以同龄昆明小鼠和C57BL/6J小鼠作为对照。于P14和P21对rd/KM和rd/B6小鼠进行ERG检测和视网膜组织石蜡切片及H E染色,记录暗视3.0 cd.s.m-2反应b波幅值,并于P21时进行眼底照相。于P56时对rd/KM和rd/B6小鼠Pde6b外显子进行测序。【结果】1.KMush/ush小鼠的表型特征和致病基因检测:KMush/ush小鼠的ERG幅值自P14起显著下降,且无法引出明显的ERG波形,其ABR阈值自P14起即显著高于对照组昆明小鼠。P7时KMush/ush小鼠的视网膜组织结构及外核层细胞数与昆明小鼠无明显区别,P14至P21外核层细胞急剧减少,P56时基本观察不到外核层细胞。眼底照相可见视网膜变薄,视网膜血管萎缩变细。KMush/ush小鼠Pde6b和Ush2a基因表达量自P14起均显著下降。外显子测序结果显示,KMush/ush小鼠Pde6b基因共存在五个突变位点,其中第7外显子第49位的点突变产生终止密码子,使得Pde6b基因转录提前终止。Ush2a基因共有25个点突变,分布于13个外显子中,其中17个为错义突变。2.KMush/ush小鼠与CBA/Ca J小鼠杂交家系的筛查与分析:ERG和ABR检测显示,KMush/ush与CBA/Ca J小鼠杂交F1代小鼠,即CBAKMush/+小鼠具有正常的视觉和听觉功能。共检测113只杂交F2代小鼠,视觉和听觉表型出现了分离,共有四种不同的表型,即仅ERG幅值降低（ERG（+））、仅ABR阈值升高（ABR（+））、ERG和ABR检测均异常（ABR/ERG（+））和两者结果均正常（ABR/ERG（-））。四种表型小鼠无性别及毛色方面的分布差异,Pde6b和Ush2a两个致病基因均表现为常染色体隐性遗传。3.KMush/ush小鼠与CBA/Ca J小鼠杂交F3代表型及基因表达检测:ERG和ABR检测结果显示,三种阳性表型的F2代小鼠的子代与其视觉和听觉功能表现基本相同。OCT检测显示F3代ERG（+）小鼠以及F3代ABR/ERG（+）小鼠外核层厚度显著变薄,F3代ABR（+）小鼠其外核层厚度与对照组CBA/Ca J小鼠并无明显差别。实时荧光定量PCR对Pde6b和Ush2a m RNA表达量的检测结果显示,具有ERG幅值降低表现的杂交F3代小鼠Pde6b表达量降低,具有ABR阈值升高表现的杂交F3代小鼠Ush2a表达量降低。4.rd/KM小鼠和rd/B6小鼠的视网膜功能、形态改变和致病基因测序:ERG结果显示,rd/KM和rd/B6小鼠自P14起视觉功能即显著下降。两种小鼠眼底可见视网膜萎缩,血管变细,rd/B6小鼠眼底可见斑块状脱色素改变。视网膜切片H&E染色显示,P14时rd/KM和rd/B6小鼠的视网膜厚度均显著变薄,外核层细胞均显著减少,P21时,基本观察不到外核层细胞。基因外显子测序显示,rd/KM和rd/B6小鼠的突变位点相同,共5个点突变,其中位于第7外显子第49位的无义突变产生终止密码子,使得Pde6b转录提前终止。【结论】1.KMush/ush小鼠的视觉和听觉功能下降以及视网膜形态结构改变是基于Pde6b和Ush2a两个基因的突变。KMush/ush小鼠可能为一种自发性、遗传性的双基因突变（Pde6b和Ush2a）小鼠。2.KMush/ush小鼠的突变基因为常染色体隐性遗传,在杂交过程中出现分离和自由组合,共产生了四种不同表型的杂交F2代小鼠,F3代小鼠的表型与其对应的亲代小鼠相一致。我们目前所筛查出的杂交F3代ERG（+）小鼠可能为单基因（Pde6b）突变小鼠;杂交F3代ABR（+）小鼠可能为单基因（Ush2a）突变小鼠,但还需要进一步观察是否存在视网膜退行性改变。3.rd/KM和rd/B6小鼠遗传背景不同,但表型相似,致病基因突变位点相同,均位于Pde6b基因第7外显子第49位,为一无义突变,使得Pde6b基因转录提前终止。