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干旱影响农作物正常生长发育,导致农作物减产,是一种最常见的非生物胁迫。而抗旱育种是目前解决干旱胁迫带来的一系列问题的最经济有效的方法。GGB基因编码Ⅰ型蛋白香叶酰基转移酶,参与蛋白异戊二烯化修饰,在ABA控制气孔关闭的功能中发挥重要的负调控作用。前人研究表明拟南芥ggb功能缺失突变体的抗旱性明显增强。经生物信息学分析发现,二倍体棉花基因组中具有1个拷贝的与拟南芥GGB高度同源的基因,但是这个基因究竟是否能和拟南芥GGB基因发挥同样的作用,在棉花抗旱生理生化机制中起什么样的功能,是否可以作为棉花抗旱育种的理想靶标基因,这得需要进一步进行探究。为此,本文开展了以下两方面的工作,首先,正确构建GbGGB基因的互补表达载体pBI101-AtGGBP-GbGGB-AtGGBT,并通过农杆菌介导的浸花法将其转入拟南芥ggb突变体,获得转基因纯系植株△Gbggb;在此基础上,以拟南芥ggb突变体和拟南芥野生型Col-0作对照,对转基因纯合株系△Gbggb进行土壤干旱胁迫处理,观察转基因植株是否功能互补拟南芥ggb突变体的表型,测定干旱处理不同时间后拟南芥叶片的叶绿素含量、渗透压调节物质含量变化和抗氧化酶类活性的差异。从而验证与拟南芥AtGGB基因高度同源的棉花GbGGB也是个抗旱负调控基因,为培育棉花抗旱新种质提供一个新的分子靶标基因选择。获得的试验结果如下:
1.从海岛棉新海16中克隆GbGGB基因,长度为1143bp;从拟南芥野生型Col-0中克隆了AtGGB基因启动子和终止子,长度分别为1820bp和576bp,采用DNA重组技术成功构建pBI101-AtGGBP-GbGGB-AtGGBT功能互补表达载体;将构建好的互补表达载体采用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥ggb突变体,收获的成熟种子在卡那霉素抗性1/2MS培养基上筛选阳性苗,通过几轮筛选获得了△Gbggb转基因纯合株系。
2.以拟南芥ggb突变体和拟南芥野生型Col-0作对照,对转基因纯合株系△Gbggb进行土壤干旱胁迫处理。试验结果表明,游离脯氨酸(Prolin,Pro)、可溶性糖(SolubleSugar,SS)、可溶性蛋白(SolubleProtein)等渗透调节物质的含量随着干旱胁迫处理时间的延长逐渐增加,ggb突变体中渗透调节物质的积累含量高于△Gbggb和Col-0;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量也随着干旱胁迫呈现上升的趋势,但是ggb突变体叶片中的MDA含量上升水平比△Gbggb和Col-0低;超氧化物歧化酶(Superoxidasegasifyingenzyme,SOD)、过氧化酶(Peroxidase,POD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)等保护酶活性呈先上升后下降的变化趋势,这时也是ggb突变体的活性比其他两个材料强;叶绿素a(Chlorophylla)、叶绿素b(Chlorophyllb)以及总叶绿素含量(Totalchlorophyllcontent)呈现逐渐下降的趋势,即,随着干旱胁迫ggb突变体的光合色素下降水平比其他两个材料低。从整个生理生化指标中可以看出,与拟南芥野生型Col-0和转基因△Gbggb植株相比,拟南芥ggb突变体表现出很强的抗旱性,而Col-0和△Gbggb植株各种生理指标变化基本一致,无明显差异。
1.从海岛棉新海16中克隆GbGGB基因,长度为1143bp;从拟南芥野生型Col-0中克隆了AtGGB基因启动子和终止子,长度分别为1820bp和576bp,采用DNA重组技术成功构建pBI101-AtGGBP-GbGGB-AtGGBT功能互补表达载体;将构建好的互补表达载体采用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥ggb突变体,收获的成熟种子在卡那霉素抗性1/2MS培养基上筛选阳性苗,通过几轮筛选获得了△Gbggb转基因纯合株系。
2.以拟南芥ggb突变体和拟南芥野生型Col-0作对照,对转基因纯合株系△Gbggb进行土壤干旱胁迫处理。试验结果表明,游离脯氨酸(Prolin,Pro)、可溶性糖(SolubleSugar,SS)、可溶性蛋白(SolubleProtein)等渗透调节物质的含量随着干旱胁迫处理时间的延长逐渐增加,ggb突变体中渗透调节物质的积累含量高于△Gbggb和Col-0;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量也随着干旱胁迫呈现上升的趋势,但是ggb突变体叶片中的MDA含量上升水平比△Gbggb和Col-0低;超氧化物歧化酶(Superoxidasegasifyingenzyme,SOD)、过氧化酶(Peroxidase,POD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)等保护酶活性呈先上升后下降的变化趋势,这时也是ggb突变体的活性比其他两个材料强;叶绿素a(Chlorophylla)、叶绿素b(Chlorophyllb)以及总叶绿素含量(Totalchlorophyllcontent)呈现逐渐下降的趋势,即,随着干旱胁迫ggb突变体的光合色素下降水平比其他两个材料低。从整个生理生化指标中可以看出,与拟南芥野生型Col-0和转基因△Gbggb植株相比,拟南芥ggb突变体表现出很强的抗旱性,而Col-0和△Gbggb植株各种生理指标变化基本一致,无明显差异。