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干细胞是具有自我复制和克隆形成能力、并能够产生多种分化细胞类型的细胞。干细胞可广泛地应用于基础研究，并且是再生医学研究的基础。再生医学的最终目标是替换失去或受损的细胞，可通过去分化、转分化或重编程三种途径完成。转分化是指将一类体细胞直接转化为另一类体细胞，而不先重编程为多能性干细胞后再分化为功能细胞。目前，已报道的转分化策略有两种，一种是直接导入多个谱系特异性的转录因子或基因；另一种是先用多能性转录因子进行短暂的去分化，在未到达多能性状态时用小分子化合物诱导分化。生殖细胞是一群高度特化的细胞，负责种群的延续和进化。生殖细胞的研究在细胞生物学、发育生物学、畜牧业生产和临床医学上都具有广阔的应用前景。生殖细胞的发生和减数分裂的起始一直是生命科学研究的热点，科学家们将胚胎干细胞、诱导性多能干细胞作为模型，在体外向生殖细胞诱导分化。但由于多能干细胞的高致瘤性及其向生殖细胞诱导效率较低，研究人员仍在探索诱导生殖细胞的其他途径。过表达Dazl基因可诱导胚胎干（ES）细胞分化为生殖细胞。Dazl基因特异表达于小鼠雄性和雌性生殖细胞，缺失将引起生殖细胞无法正常发育且减数分裂被阻滞。Ddx4基因也特异表达于生殖细胞，缺失将造成生殖细胞出现增殖和分化缺陷。miR302/367簇可将体细胞重编程为诱导性多能干细胞，且诱导效率可能高于多能性转录因子。本研究克隆了小鼠生殖细胞特异性基因Dazl和Ddx4，并构建了其真核表达载体，为后续体细胞向生殖细胞转分化的研究提供了可能需要的载体材料。本研究还构建了miR302/367簇的慢病毒表达载体，感染HEK293T细胞后用N2B27培养液诱导，初步探究了其对去分化和重编程的作用，以及诱导生殖细胞形成的作用，为后续体细胞向生殖细胞转分化的研究提供了可能需要的载体材料和相关诱导方法1.小鼠生殖特异性基因Dazl和Ddx4真核表达载体的构建本研究根据GenBank数据库的信息，用Primer Premier5软件设计了小鼠Dazl和Ddx4基因编码区序列的扩增引物。以小鼠睾丸组织cDNA为模板，RT-PCR扩增目的片段，与pMD18-T载体连接正确后测序。将测序正确的目的片段与pEGFP-C1或pIRES2-EGFP载体分别双酶切并连接，构建pDazl-EGFP-C1和pDdx4-IRES2-EGFP重组载体。将重组载体分别转染入HEK293细胞和NIH3T3细胞，QRT-PCR和免疫荧光验证载体表达功能和在细胞中的定位正常。2. miR302/367诱导HEK293T细胞重编程及向生殖细胞分化的初步研究以小鼠基因组DNA为模板，PCR扩增miR302/367簇的序列，与pMD18-T载体连接并测序。将测序正确的目的片段与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体双酶切并连接，构建pCDH-miR302/367慢病毒重组载体。将HEK293T细胞感染miR302/367慢病毒，在DMEM/F12和Neurobasal培养液的基础上，添加N2、B27、LIF、谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、BSA、PD0325901和CHIR9902、Vc、bFGF等，诱导HEK293T细胞去分化和重编程形成类似iPS的mirPS细胞。RT-PCR、QRT-PCR和免疫荧光检测诱导的mirPS细胞表达多能性标记基因和蛋白。将mirPS细胞悬浮培养形成类胚体，贴壁诱导7天，免疫荧光检测其表达具有三胚层和软骨细胞、生殖细胞标记蛋白。将mirPS细胞移植到白消安处理的模型雄鼠肾被膜下，9周后检测有瘤状结构，组织切片免疫荧光检测具有向生殖细胞分化的潜能。