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1、研究背景乳腺癌是威胁女性健康的头号杀手,其发病率位居女性肿瘤之首。乳腺癌远端转移是导致癌症患者死亡的主要原因。目前,临床上针对乳腺癌转移常以HER2、EGFR、VEGFR为靶点,开发靶向药。乳腺癌转移是多步骤发展的过程,其主要步骤为:具有侵袭转移能力的乳腺癌细胞脱离原发灶,浸润周围组织;肿瘤细胞穿透血管壁进入血液,通过血液循环进行远端转移;肿瘤细胞在远端器官上形成新的转移灶。乳腺癌远端转移灶常发生于肝、肺、脑和骨器官。上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程是乳腺癌转移的重要环节。已有的研究发现:影响乳腺癌转移的因素主要有类固醇激素、转化生长因子-β(TGF-β)、基质金属蛋白酶(MMPs)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和外泌体等。p62蛋白是具有多功能结构域的枢纽蛋白,在细胞自噬过程中作为自噬底物扮演着重要的作用。越来越多的研究发现p62蛋白在肿瘤的发生发展中具有重要的调控作用。p62可通过自噬非依赖途径调控肿瘤的增殖、转移和干性。p62的高表达可作为预测乳腺癌患者预后不良的指标。对于p62蛋白是如何调控乳腺癌转移的作用机制研究还很少。乳腺癌转移调控机制的研究,可以为临床上抑制乳腺癌转移的选择用药提供更好的依据。3、研究方法本实验采用乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-10A、MCF-7进行实验研究。1、比较乳腺癌细胞系p62的表达水平,得出在MDA-MB-231细胞系中p62表达量高;MCF-10A、MCF-7细胞系里表达量低。然后在231细胞系里敲低p62水平,同时在MCF-10A、MCF-7中高表达p62,利用tranwell实验研究乳腺癌细胞的侵袭转移能力,并用基质胶模拟胞外基质,得出p62的表达量水平对乳腺癌细胞系转移的影响。2、通过对乳腺癌细胞系进行三维培养,用基质胶模拟体内环境,研究p62表达水平的改变对肿瘤细胞的生长形态的影响。3、绘制乳腺癌患者的生存曲线。在GEO数据库里下载公共数据GSE6532和GSE1379。4、数据库分析预测p62调控乳腺癌的下游靶点。在c Bio Portal和Bio Grid数据库里,搜索与p62相互作用的蛋白,在String网站和DAVID网站进行GO分析。3、研究结果1、p62促进乳腺癌细胞的侵袭转移能力。在MDA-MB-231细胞系中敲降p62,其穿过transwell小室的细胞数目减少;在MCF-7和MCF-10A细胞系中高表达p62,划痕实验显示,在一定时间内细胞移动的距离增加,transwell实验中穿过的细胞数目也增加。2、p62影响乳腺癌细胞的生长形态。正常MDA-MB-231细胞在二维培养条件下生长分散,三维培养中呈现分枝状,向外扩张,免疫荧光实验结果为波形蛋白(Vimentin)广泛分布于细胞基质中;敲降p62后,三维培养中显示231细胞呈球状生长,不向外扩散,免疫荧光结果显示此时Vimentin聚缩在核外。3、p62低表达患者生存期高于p62高表达的患者。4、p62调控乳腺癌转移的靶点预测。p62相互作用蛋白在NF-кB和MAPK的信号通路上有富集,p62还与一部分蛋白激酶有相互作用,预测RIPK、PRKC是p62影响乳腺癌转移过程中的靶基因。4、研究结论(1)过表达p62促进乳腺癌细胞系转移。(2)RIPK、PRKC是p62影响乳腺癌转移过程中的预测靶点。