Cre-LoxP位点特异性重组系统属于定位重组系统之一,是目前国内外研究和应用比较广泛的一种位点特异性重组系统。Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre重组酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。其应用主要包括基因失活或敲除、基因激活、基因颠换、基因易位,还可以利用此系统进行载体的构建。目前,各类病毒载体为基因治疗提供了重要的研究工具,从病毒在神经元细胞建立潜在感染的能力来看,单纯疱疹病毒(HSV,herpes simplex virus)特别适合于神经元产生基因,因此HSV广泛应用于神经内科疾病的基因治疗研究中。细菌人工染色体(BAC,bacterial artificial chromosome)技术,即在BAC基础上的全长基因组感染性克隆技术的应用使HSV-1载体构建发展到新的阶段,该技术使HSV-1基因组在BAC质粒内稳定表达,并能对其基因进行操作。BAC质粒克隆有LoxP位点,便于载体构建过程中Cre重组酶与其发生重组反应,从而将BAC主体片段删除,得到HSV载体;HSV扩增子构建中,LoxP位点之间携带有包装信号,Cre重组酶的作用能去除包装信号。通过以上途径,完善HSV载体以便进行神经内科疾病基因治疗研究。本实验通过构建Cre重组酶表达质粒,建立Cre重组酶表达阳性的vero-Cre细胞系。HSV-1载体感染该细胞后既能产生病毒,同时将LoxP位点之间的BAC片断删除;HSV-1扩增子载体构建过程中,应用Cre-LoxP系统切除辅助病毒的包装信号Pac产生扩增子病毒,达到了大幅减少辅助病毒的同时又增加扩增子病毒滴度的目的。目的:构建cre重组酶慢病毒表达质粒,建立cre重组酶表达阳性的vero-Cre细胞系,利用cre-Loxp重组反应为HSV-1载体构建过程中BAC质粒的去除和扩增子构建过程中包装信号的切除提供实验材料。方法:1.通过限制性内切酶NcoⅠ和EcoRⅠ双酶切获取载体c66-pGEM-T-SV40-Cre中约2kbp的Cre重组酶片段,连接到经SalⅠ和EcoRⅠ酶切的慢病毒载体pLKO.1-puro上,形成重组质粒pLKO.1-puro-Cre;转化大肠杆菌(escherichiacoli,E.coli)DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,MluI和EcoRⅠ双酶切鉴定。2.将重组载体质粒pLKO.1-puro-Cre、包装质粒△8.2和包膜质粒VSV-G经转染试剂FuGENE6共转染293T细胞,产生稳定表达Cre重组酶的慢病毒颗粒。3.病毒颗粒感染vero细胞,采用嘌呤霉素最小致死量筛选病毒感染细胞的方法,得到Cre重组酶表达阳性的vero-Cre细胞,并挑取单个克隆形成阳性细胞系。4.通过PCR扩增vero-cre细胞DNA中的cre片段,BAC质粒转染至细胞系鉴定功能,且对GFP阳性细胞数目进行统计学分析。结果:1.双酶切得到Cre重组酶片段,重组到慢病毒载体质粒PLKO.1-puro中后,相应地筛选出阳性菌落。2.重组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro-Cre经过酶切鉴定显示重组质粒构建成功。3.三质粒共转染293T产生出慢病毒颗粒4.筛选出嘌呤霉素对vero细胞的最小致死浓度为8μg/ml,重组慢病毒感染vero细胞,并筛选出Cre重组酶表达阳性的细胞克隆。5.PCR扩增出560bp的片段,BAC质粒转染至vero和vero-Cre细胞后,GFP阳性细胞数有显著性差异(p＜0.01)。结论:成功构建功能性稳定表达Cre重组酶的vero细胞系,为HSV-1载体的构建及其应用奠定了基础。