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BTG2基因属于BTG/TOB基因家族的重要成员,具有抗增殖和促分化的功能,我们在前期用抑制消减杂交技术对四月龄大白猪和梅山猪肌肉组织差异表达分析中发现BTG2基因表达量在品种间有极显著差异。而BTG1和BTG3基因作为其家族基因,已有报道认为它们在肌纤维的分化和生长过程中扮演着重要角色。鉴于此,本研究采用差异表达基因策略,选择BTG2、BTG1和BTG3基因作为影响猪肌肉生长发育的候选基因,开展了阶段性和不同组织表达变化规律、基因序列、遗传变异、基因结构、多态性与性状关联等方面的研究,获得如下研究结果:
1、运用实时定量PCR的方法,检测了BTG2基因在大白和梅山猪胚胎期65d、出生后3d、35d、60d、120d和180d的背最长肌cDNA中的表达情况;检测了BTG1,BTG3在通城猪和大白猪出生后3d、21d、35d、60d、90d和120d背最长肌cDNA中的表达情况。结果表明:BTG2基因在肌肉发育不同阶段的表达趋势,在大白和梅山猪中具有相似趋势,均是先上调再下调,各阶段的表达量差异达到了极显著的水平(p<0.01);不同的是:BTG2基因在大白猪二月龄表达量达到最高,而在梅山猪中则是四月龄。BTG1基因在大白猪6个阶段的表达量呈逐渐下调趋势(p<0.01),在通城猪中则是先下调再上调,然后逐渐下调(p<0.01);品种问比较,大白猪和通城猪3d、21d、60d、90d的表达量差异都达到了极显著的水平(p<0.01)。BTG3基因在大白和通城猪肌肉生长发育不同阶段中的表达趋势大致相同:均是前期低表达,后期高表达,120d表达量最高;在两品种之间,除了出生后3d的表达量没有显著差异外,各阶段的表达量差异达到了显著的水平(p<0.05)。
2、用RT-PCR的方法检测了BTG2、BTG1和BTG3三个基因在成年大白猪子宫、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织、半腱肌和背最长肌中的表达规律。结果表明,BTG2基因在心肌、半腱肌和背最长肌中高表达,在子宫、肾脏和脾脏中中等程度表达,在肝和脂肪中低表达。BTG1和BTG3基因在子宫、肝脏和脾脏中相对高表达,在肾脏和脂肪组织中中等程度的表达,而在心肌、半腱肌和背最长肌中低表达。
3、采用生物信息学分析方法和RACE等技术,以“大白猪-梅山猪”抑制消减文库中获得的差异表达序列(ESTs)为基础,获得了BTG2基因全长cDNA序列和基因组序列以及BTG1基因的部分cDNA序列。推导了猪BTG2基因的氨基酸序列,采用生物信息学的方法预测了它的结构和功能,发现BTG2基因推导氨基酸序列除具有BTG/TOB基因家族所共有的boxA和boxB保守结构域外,还含有3个蛋白激酶的磷酸化位点。
4、在序列测定和比对基础上,建立了BTG2基因内含子1的Psp5Ⅱ-RFLP分型技术和BTG1基因3’非翻译区的Bsh1236Ⅰ-RFLP检测方法。对大白猪、梅山猪、二花脸猪、杜洛克猪、清平和长白猪进行的群体遗传学分析结果表明:两个SNP位点在中国地方猪种和引进猪种中的分布存在极显著的差异。利用“大白×梅山”资源家系F2群体,开展的BTG2和BTG1基因SNP与生产性状相关性研究发现:BTG2基因Psp5Ⅱ-RFLP位点的不同基因型与肥肉率、6-7肋背膘厚、平均背膘厚、胴体长存在显著相关,与臀部背膘厚和瘦肥肉比例成极显著的相关;GG基因型为增加瘦肉率和降低背膘厚的基因型。BTG1基因3’非翻译区Bsh1236Ⅰ-RFLP位点的基因型与皮率、瘦肉率、臀部背膘厚、肌内脂肪含量存在显著相关,与肌内水分和眼肌面积成极显著的相关;BTG1基因AA基因型是有利于降低背膘厚和提高瘦肉率的基因型。