灵猫方抑制中性粒细胞浸润及活化预防急性肝损伤的机制研究

来源 :上海中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huangyi802
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目的:研究灵猫方抑制中性粒细胞浸润及活化预防急性肝损伤的免疫机制。方法:1.观察α-Galcer急性肝损伤小鼠模型的中性粒细胞浸润情况:(1)分组:将50只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组(以下称对照组)、3h模型组、9h模型组、16h模型组、24h模型组,每组10只。(2)给药方法:经小鼠尾静脉一次性注射α-Galcer(100mg/kg体重),建立急性肝损伤模型,分别于注射3h、9h、16h、24h后处死。(3)各指标检测方法:赖氏法检测血清ALT、AST表达水平;HE染色观察小鼠肝脏病理变化情况;免疫组化法检测肝脏中性粒细胞的浸润情况;微量样本多指标流式蛋白定量技术检测小鼠血清细胞因子和趋化因子的表达水平。2.灵猫方通过抑制中性粒细胞浸润及活化预防α-Galcer模型小鼠急性肝损伤的机制:(1)分组:将50只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型对照组(以下称模型组)、中药低剂量预防组(以下称低剂量组)、中药中剂量预防组(以下称中剂量组)、中药高剂量预防组(以下称高剂量组),每组10只。(2)给药方法:低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠,分别按照5ml/kg、10ml/kg、20ml/kg体重给予灵猫方灌胃,每天一次,连续七天;第七天灌胃后,经小鼠尾静脉一次性注射α-Galcer(100mg/kg体重),16h后处死。(3)各指标检测方法:赖氏法检测血清ALT、AST表达水平;HE染色观察小鼠肝脏病理变化情况;免疫组化法检测肝脏中性粒细胞的浸润情况;微量样本多指标流式蛋白定量技术检测血清细胞因子及趋化因子的表达水平;Real-Time PCR法检测肝组织Ly6G m RNA表达水平;Western Blot法检测肝组织p-AKT/AKT、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK,p-P38/P38信号分子的表达水平;流式细胞术检测肝脏中性粒细胞ROS的表达水平;ELISA法检测肝组织MDA和4-HNE的表达水平。结果:1.α-Galcer急性肝损伤小鼠模型中性粒细胞的浸润情况:与正常组相比,16h模型组、24h模型组血清ALT、AST水平明显上升(P<0.001),16h模型组、24h模型组可见肝组织片状坏死,各模型组肝内浸润的MPO阳性中性粒细胞数量增多且16h模型组最多(P<0.001),16h模型组血清促炎因子IFN-γ表达最强(P<0.001),血清趋化因子检测9h模型组血清趋化因子Eotaxin、RANTS明显增加(P<0.001),3h模型组血清趋化因子KC明显增加(P<0.001)。2.灵猫方通过抑制中性粒细胞浸润及活化预防α-Galcer模型小鼠急性肝损伤的机制研究:(1)灵猫方对急性肝损伤小鼠肝脏病理改变的预防作用:与正常组相比,模型组血清ALT、AST表达水平明显升高(P<0.001),模型组肝组织片状坏死、周围出现大量炎症细胞浸润;与模型组相比,高剂量组血清ALT、AST水平明显降低(P<0.001),高剂量组肝组织片状坏死减少、炎症细胞浸润面积缩小。(2)灵猫方对小鼠肝内中性粒细胞浸润的调节作用:与正常组相比,模型组肝脏内浸润的MPO阳性中性粒细胞数量增加(P<0.01),肝组织Ly6G m RNA表达上升(P<0.05),肝组织MDA和4-HNE表达水平明显上升(P<0.001);与模型组相比,中剂量组和高剂量组MPO阳性中性粒细胞数量减少(P<0.01),高剂量组Ly6G m RNA表达下降(P<0.05),高剂量组MDA和4-HNE表达降低(P<0.05)。(3)灵猫方对小鼠肝脏炎症相关细胞因子和趋化因子的调节作用:与正常组小鼠相比,模型组肝组织细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2表达水平明显升高(P<0.001),模型组肝组织趋化因子RANTES、KC、BLC表达水平明显升高(P<0.001);与模型组相比,高剂量组促炎因子IFN-γ、IL-2表达水平明显降低(P<0.001),高剂量组趋化因子RANTES、KC表达水平明显降低(P<0.005)。(4)灵猫方对小鼠肝脏炎症相关信号通路的调节作用:与正常组相比,模型组小鼠肝脏p-ERK、p-JNK、p-P38、p-AKT表达水平升高(P<0.05);与模型组相比,高剂量组p-ERK、p-JNK、p-AKT表达水平降低(P<0.05)。结论:1.灵猫方通过抑制α-Galcer急性肝损伤模型小鼠体内中性粒细胞的浸润,预防急性肝损伤。2.灵猫方通过减少肝脏ROS、MDA、4-HNE的表达水平,抑制浸润肝脏的中性粒细胞的氧化应激反应,预防急性肝损伤。3.灵猫方通过减少促炎因子IL-2、IL-5的表达,减少中性粒细胞相关趋化因子KC、MCP-1和巨噬细胞相关趋化因子MDC、TARC的表达,抑制了肝脏内中性粒细胞的浸润和集聚,预防急性肝损伤。
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