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短链脱氢酶广泛存在微生物细胞之中,除了在生理功能上涉及糖、醇、脂类、氨基酸、碳氢化合物、辅酶、荷尔蒙、异生物质等多种代谢,还是一类在生物催化与转化上备受关注的生物催化剂,在理论和应用方面的研究具有重要意义。本实验以三种不同菌种基因组为模板,PCR扩增得到三个短链脱氢酶基因,分别构建表达质粒并在E. coli BL21(DE3)中表达,并研究了相关酶学性质,结果如下：1.从荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens GZM1.49)基因组DNA克隆得到了编码短链脱氢酶的基因pfd,该基因全长684bp,编码227个氨基酸。重组PFD分子大小为28kDa,具有嗜冷酶的催化特征,能氧化4-氯-3-羟基丁酸乙酯、1-苯乙醇、苯甲醇、仲丁醇和还原4-氯-乙酰乙酸乙酯、2-溴-苯乙酮、4-溴-苯乙酮等底物。以4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物时活力最高,Km值为186.90mmol/L, Vmax为89.56U/mg。氧化4-氯-3-羟基丁酸乙酯时,最适反应温度和pH分别为12℃和10.5,倾向于利用NAD+作辅酶；而还原4-氯-乙酰乙酸乙酯时,最适温度和pH为24℃和8.8,倾向于利用NADPH作辅酶。重组PFD能耐受50%(V/V)的甲醇等有机助溶剂,低浓度的EDTA对其酶活有一定的促进作用。2.从地表地芽孢杆菌Geobacillus subterraneus基因组DNA克隆得到了编码短链脱氢酶的基因gsd,该基因全长555bp,编码184个氨基酸。重组GSD分子大小为24kDa,具有嗜热酶的催化特征,底物谱较广。以丙酮酸乙酯为最适氧化底物,Km值为20.25mmol/L,Vmax为238.10U/mg,最适反应温度和pH分别为65℃和10.5；还原乳酸乙酯时,最适温度和pH为65℃和7.5。重组GSD既能耐受浓度高达70%(V/V的甲醇溶剂,又能同时利用NAD(H)和NADP(H),可用于构建辅酶再生体系。除此之外,重组GSD热稳定性强,低浓度的金属离子和EDTA对其酶活的影响不大。3.从铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa A006)基因组DNA克隆得到的编码短链脱氢酶的基因pad,该基因全长825bp,编码274个氨基酸,理论计算重组PAD分子大小为30kDa。BLAST分析显示该基因序列与Pseudomonas aeruginosa PAO1(ABJ12131)短链脱氢酶基因的同源性为100%。