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miRNA（微小核糖核酸）是一种长度大约为22个nt（核苷酸）的非编码RNA,通过和靶标基因的mRNA（信使核糖核酸）碱基互补配对在转录后水平抑制基因的表达。先前大量的研究报道miRNA在肿瘤形成和迁移中起着重要的作用。人类编码的miR-17-92簇首次被发现可以引起肿瘤的发生因而被命名为"oncomiR-1".人类miR-17-92簇编码]miR-17、miR-18、miR-19a、miR-20a、 miR-19b和miR-92等6个miRNA。miRNA基因芯片数据显示人类miR-17和miR-20a在直肠癌、胰腺癌和子宫颈癌中都呈现特异性表达。第一个被鉴定的也是唯一一个被广泛证明的miR-17和miR-20a的靶标基因是E2F1,随后的研究表明E2F家族的其他蛋白因子E2F2和E2F3也受到miR-17和miR-20a的调控。另外,还有实验数据显示E2F蛋白家族的所有成员作为转录因子,可以直接结合到miR-17-92簇的启动子区域,在转录水平增强miR-17-92簇的表达,从而和miR-17-92簇形成负反馈的调节机制。负反馈的机制诠释了miR-17和miR-20a和靶标基因E2F家族的调控模式,但是因为E2F家族是增强miR-17-92簇的转录,miR-17和miR-20a对E2F家族的抑制作用导致E2F家族对miR-17-92簇转录增强的降低,所以通过负反馈机制miR-17和miR-20a最终导致对自身的表达抑制,而这无法解释为什么miR-17和miR-20a在癌症组织中维持高水平的表达,因此miR-17和miR-20a在癌症组织中必然通过调控其他靶标基因行使生物学功能,miR-17和miR-20a在癌症组织中维持其高表达的调控机制也有待研究证明。本研究为了鉴定miR-17和miR-20a的靶标基因,建立了一种将miRNA蛋白复合物纯化和miRNA作为逆转录引物结合的可以在细胞内鉴定miRNA靶标基因的实验方法,我们称之为miRACE。利用miRACE的方法,本研究成功的在Hela细胞系内鉴定出miR-17和miR-20a的新靶标基因DAPK3, miRNA-17和miR-20a的靶标位点位于DAPK3的第二个外显子上。Ago2紫外交联免疫共沉淀的高通量数据显示位于第二个外显子的靶标位点有着富集的Ago2结合信号。生物素标记的miR-17和miR-20a亲和纯化结果证实了miR-17和miR-20a与DAPK3信使RNA的特异性结合。Western blot和定量PCR的结果证实miR-17和miR-20a在翻译水平抑制DAPK3的表达,miR-17和miR-20a的高表达降低细胞内DAPK3的蛋白水平,阻断miR-17和miR-20a提高DAPK3的蛋白水平,而DAPK3的信使RNA不受miR-17和miR-20a的表达调控。以上结果表明miR-17和miR-20a通过结合DAPK3的第二个外显子的靶标位点,在转录后水平抑制DAPK3的表达。本研究进一步的证明DAPK3介导miR-17和miR-20a的生物学功能。小鼠大腿皮下注射原位成瘤显示miR-17和miR-20a通过降低DAPK3的表达促进肿瘤的形成,野生型DAPK3的高表达部分回复miR-17和miR-20a对肿瘤形成的促进作用,突变性的DAPK3的高表达则完全抵消miR-17和miR-20a对肿瘤形成的促进作用。已有的证据显示miR-17和miR-20a受到表达抑制时会引起DNA双链断裂使细胞进入细胞周期阻滞,DNA双链断裂是根据γH2AX在细胞核内形成灶（foci）判定。本研究发现γH2AX免疫荧光实验显示miR-17和miR-20a阻断引起的DNA双链断裂依赖于DAPK3。与体内阻断miR-17和miR-20a一致,DAPK3的高表达诱导产生DNA双链断裂形成γH2AX foci,阻断miR-17和miR-20a的同时用RNAi的方法敲除DAPK3阻止γH2AX foci的形成。以上结果表明高表达的miR-17和miR-20a通过抑制DAPK3的表达促进肿瘤形成,miR-17和miR-20a受到表达抑制时引起DAPK3的表达增强,通过诱导形成DNA双链断裂使细胞进入细胞周期阻滞。本研究还揭示了DAPK3通过磷酸化激活p53抑制miR-17和miR-20a的转录,DAPK3和miR-17/20a形成正向反馈的相互作用机制。定量PCR显示DAPK3的高表达降低miR-17-92簇中各miRNA成熟体的表达量,也降低miR-17-92簇前体的表达水平,表明DAPK3抑制miR-17-92簇的转录。DAPK3对miR-17-92簇的转录抑制依赖与p53蛋白的存在,在HCT116 p53敲除的细胞系内DAPK3对miR-17-92簇的转录抑制作用被解除,而特异识别P53二十位丝氨酸磷酸化抗体的western blot的结果证实了DAPK3在细胞内可以p53磷酸化。这些结果证明DAPK3通过磷酸化激活p53,在转录水平抑制miR-17-92簇的表达,DAPK3与miR-17和miR-20a形成了负反馈的调节机制。综上所述,本研究通过建立基于miRNA蛋白复合物纯化和miRNA为引物进行逆转录的试验方法,鉴定了miR-17和miR-20a的靶标基因DAPK3。证实了DAPK3不仅可以介导miR-17和miR-20a的生物学功能,还通过转录抑制miR-17-92簇的转录与miR-17和miR-20a形成正向反馈的相互作用。本研究发现的正向反馈机制阐明了miR-17和miR-20a在癌症细胞中保持高水平表达的机理,也为针对由miR-17和miR-20a引起的癌症的临床治疗提供了潜在的药物靶标。