共轭亚油酸的生物转化和异构体分析

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共轭亚油酸(CLA)是一组位置和几何异构体的十八碳共轭二烯酸的统称,在自然界,CLA主要存在于反刍动物的奶、肉及其制品的脂肪中,通常每克脂肪中CLA的含量为2.5-17.7mg,其异构体主要是c9,t11-CLA。体内外实验均表明c9,t11-CLA有抗癌活性。通过化学合成或生物转化法可以大量制备CLA,但化学合成的CLA异构体组成复杂,无法获得单一的CLA异构体,生物转化法在亚油酸异构酶的作用下,可以获得单一的CLA异构体,如c9,t11-CLA、t10,c12-CLA。 本文通过尿素包合法获得纯度较高的亚油酸,采用紫外光谱扫描和HPLC方法筛选到一株高产CLA的乳酸菌,建立了CD-MEKC分析CLA异构体的新方法,通过FTIR、GC-MS、NMR确定了产物的组成,对乳酸菌生物转化CLA的条件进行了优化和放大,并对其亚油酸异构酶进行了初步研究,主要研究结果如下: 1.尿素、溶剂和脂肪酸配比是影响尿素包合法纯化玉米油中亚油酸的主要因素,当混合脂肪酸:尿素:乙醇为1∶3∶6(w./w./v.)时,回流15min,包合2h,在室温下,通过一次包合,亚油酸的纯度从44.48%提高到95.68%,得率为72.41%。 2.紫外光谱扫描和HPLC相结合的筛选方法具有快速、准确的优点。通过该方法从33株乳酸菌中筛选到L.acidophilus(CGMCC 1.1854)、L. casei subsp.casei(CGMCC 1.574)、L. plantarum L1和L. helveticus L7共4株乳酸菌能生物转化CLA,它们生物转化得到的CLA均由c9,t11-CLA和t9,t11-CLA两种异构体组成。L. helveticus L7在MRS培养基上生成的c9,t11-CLA的量最高(p<0.05)。培养基对乳酸菌生物转化CLA有影响,能生物转化CLA的乳酸菌在种上没有规律性。 3.建立了CD-MEKC分析CLA异构体的新方法,最优分析条件是4%(w./v.)B-CD、54mM SDS、80raM硼酸盐(pH9.0)、8M尿素、4%(v./v.)乙醇、分离电压30kV、毛细管柱温15℃。CD-MEKC优于目前常用的GC和Ag+-HPLC两种方法,实现了CLA异构体的快速、准确分析。CD-MEKC分析L. helveticus L7生物转化的CLA产物由c9,t11-CLA和t9,t11-CLA组成。 4.通过紫外光谱、傅立叶变换红外光谱、气相色谱-质谱联用分析、1H NMR、重水交换1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、clean-TOCSY和NOESY分析,确证了L. helveticus L7生物转化的两种异构体是c9,t11-CLA和t9,t11-CLA。
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