溃疡性结肠炎(UC)是以结肠和直肠最深层组织慢性溃疡为特点的病程长、病因复杂的疾病,其症状常表现为腹痛、痉挛、腹泻和/或血便,也可能发展出危及生命的并发症,并且,长期不愈的溃疡性结肠炎会导致结直肠癌(CRC)的发生。对症治疗在溃疡性结肠炎治疗中占据了重要的地位,因为其本身易于在临床中操作,并被患者和医生广泛接受,但效果并不十分理想。对于溃疡性结肠炎易感个体来说,体内紊乱的免疫系统可能造成对肠道细菌产生的抗原成分的不恰当的免疫应答。异常的免疫应答可造成促炎症因子、多种白介素和肿瘤坏死因子α (TNF-α )的过表达。溃疡性结肠炎的病因复杂,包括免疫,代谢,遗传和环境等多种因素,溃疡性结肠炎导致结直肠癌的机理也尚不明确。研究表明,胰高血糖素样肽-2 (GLP-2),白介素35 (IL-35),以及CD8~+T细胞在人体免疫与代谢中起重要的作用。胰高血糖素样肽-2是一种胃肠道激素,可以增加肠道消化、吸收和屏障功能。白介素35是白介素12家族的最新成员,在诱发炎症方面发挥重要作用。CD8~+T细胞的主要作用是控制感染并且抑制肿瘤的发展。CD8~+T细胞可以进一步分化为功能性的细胞毒性T细胞,从而分泌各种促炎性细胞因子。根据以上研究推测,胰高血糖素样肽-2、白介素35和CD8~+T细胞的失调极有可能与溃疡性结肠炎和结直肠癌的发生发展相关。本课题探讨了胰高血糖素样肽-2、白介素35和CD8~+T细胞在溃疡性结肠炎的改变以及相关机制。另外,还初步探讨了这些因素在结直肠癌中的变化和作用。研究共分2个部分。1.探讨胰高血糖素样肽-2、白介素35和CD8~+T细胞在溃疡性结肠炎的改变和作用研究目的:探明胰高血糖素样肽-2、白介素35和CD8~+ T细胞在溃疡性结肠炎外周血的改变,以及深入了解白介素35对患者T细胞及B细胞的影响。研究方法:建立大鼠溃疡性结肠炎模型,检测血清中胰高血糖素样肽-2、白介素35和CD8~+T细胞在外周血的含量。另取18名处于疾病活动期的溃疡性结肠炎患者及18名健康对照,其中患者按照不同严重程度进行分组。检测血清胰高血糖素样肽-2和白介素35的水平,以及CD8~+T细胞在外周血的比例。运用负性磁力分拣技术采用人CD8~+ T细胞浓缩试剂盒和人B细胞浓缩试剂盒从外周血单个核细胞中分离出CD8~+ T细胞和B细胞。CD4+CD25+调节性T细胞由人CD4+CD25+ T细胞分离试剂盒阳性分选。并通过体外细胞实验检测人类患者中白介素35对T细胞和B细胞的作用,以及相应的传导通路。用Welch’ s t检验(参数检验)或者曼-惠特尼检验(非参数检验)比较两个数据集。多个数据集的比较用单因素或者多因素ANOVAs,遵循Bonferroni’ s (参数化的)或者Dunn’ s (非参数化的)事后测验。所有检验均用PRISM 5软件。结果:溃疡性结肠炎大鼠血清中胰高血糖素样肽-2的含量较对照组无明显改变,而血清白介素35的水平则明显降低,CD8~+T细胞比例略有上升。人类患者胰高血糖素样肽-2在血清中的水平呈现离散状态,进一步层化分析显示轻中重度患者胰高血糖素样肽-2的水平相当。白介素35在血清中的水平则显著减少,层化分析显示重度患者的血清白介素35水平比轻度患者进一步显著降低。CD8~+ T细胞在患者外周血中的比例略有上升,不同严重程度的患者之间未见明显差异,而重度患者的CD8~+T细胞水平较健康对照组有明显升高。进一步研究白介素35的作用显示,用白介素35预处理外周血单个核细胞(PBMCs)可以显著提高外周血单个核细胞和B细胞的白介素10的分泌,然而,用白介素12或者白介素27预处理外周血单个核细胞则不能产生类似的效果。白介素35抑制CD4+CD25-传统T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞和CD8’ T细胞的增殖,但是并不能抑制B细胞的增殖。白介素35介导的B细胞分泌白介素10不需要调节性T细胞的存在。为了检验白介素35处理的B细胞对CD4-CD25-T细胞和CD8~+ T细胞的抑制作用增强是否仅局限在溃疡性结肠炎患者中,我们用取自健康对照的T细胞和B细胞重复以上实验。实验发现,白介素35处理的来自健康对照的B细胞也能显著性抑制CD4+CD25-T细胞分泌干扰素γ、白介素17和肿瘤坏死因子α,同时也能抑制CD8~+T细胞产生干扰素γ和肿瘤坏死因子α。此外,通过封闭白介素10和单克隆抗体封闭白介素10受体可消除白介素-35处理的B细胞对CD4+CD25-T细胞和CD8~+T细胞增殖的抑制作用。然而,用白介素35干预可以调节白介素5和白介素13的分泌并未得到证实。用酶联免疫分析的方法滴定重组人白介素12、白介素27、白介素35和牛血清蛋白。实验结果显示,酶联免疫吸附测定有效地检测出白介素35,但是其他细胞因子则未被测出。然后,我们检测了溃疡性结肠炎患者结肠黏膜的白介素35的表达。数据显示这些患者的炎症组织和非炎症组织分泌的白介素35都显著低于健康对照组,这一表现与p35转录受抑制有关。分泌白介素35较高的溃疡性结肠炎患者,他们的结肠黏膜也表达较高水平的白介素10。结论:胰高血糖素样肽-2在溃疡性结肠炎的外周血中并无明显改变,而白介素35则明显下降,并与疾病严重程度相关。重度溃疡性结肠炎患者的外周血CD8~+T细胞有显著上升。白介素35可以通过促进调节性B细胞的功能介导抗炎作用,但是这一作用在溃疡性结肠炎患者中受到抑制。2.初步探讨胰高血糖素样肽-2、白介素35和CD8~+T细胞的亚型在结直肠癌中的改变和作用研究目的:结直肠癌是世界第三大流行性癌,并在癌相关死亡率中占有相当大的比例。胰高血糖素样肽-2、白介素35和CD8~+T细胞在肠道的代谢、炎症和免疫反应等方面发挥重要作用,推测可能与结直肠癌的发生发展有关。另外,由于CD8~+T细胞是抗肿瘤免疫中最重要的细胞之一,此类细胞的一个亚型(CXCR5+CD8-T细胞)被发现有强烈的促炎性作用,故可能影响癌症的进程。本课题试图揭示结直肠癌中胰高血糖素样肽-2、白介素35和CD8’ T细胞的改变以及CXCR5+CD8~+ T细胞的作用。研究方法:检测7名患者和7名健康人血清胰高血糖素样肽-2、白介素35和CD8~+T细胞的水平。另外,从外周血单个核细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞和肿瘤相关的淋巴结的浸润淋巴细胞使用细胞滤器分离并使用抗人CD3、CD4、CD8和CXCR5抗体获得CXCR5+CD8~+T细胞。对细胞内因子和转录因子检测,表面标记后,细胞使用Cytofix/Cytoperm缓冲剂和转录因子缓冲液孵育。检测外周血单个核细胞以及肿瘤组织中CXCR5+CD8~+T细胞的数量。体外实验检测CXCR5+CD8~+T细胞的脱颗粒作用和肿瘤坏死因子α与干扰素γ的表达,以及CXCR5+CD8~+T细胞对自体B细胞的作用。数据使用GraphPad Prism进行分析。部分数据使用one-way AN0VA法进行Tukey’ s多重比较。部分图中的数据使用非配对t检验和Welch’ s校正法进行分析。其他数据使用two-way ANOVA和Sidak’ s多重比较。数据P<0. 05时有统计学意义。结果:患者和健康人血清胰高血糖素样肽-2和白介素35的水平并无明显差异,而外周血CD8~+ T细胞的比例较对照组略有升高,且呈现明显的离散状态。进一步研究CD8~+ T细胞的亚型显示,CXCR5+CD8~+T细胞在健康人和结直肠癌患者的外周血单个核细胞中数量较少,但是在切除的肿瘤和肿瘤相关淋巴结中该细胞比例显著上升。在体外培养条件下,CXCR5+CD8~+T细胞比CXCR5-CD8~+T细胞有更低的脱颗粒作用和肿瘤坏死因子α、干扰素γ表达。但在丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)刺激之后,CXCR5+CD8~+ T细胞脱颗粒作用和肿瘤坏死因子α的表达提高到可以与CXCR5-CD8~+ T细胞相当的程度。而刺激之后CXCR5+CD8~+T细胞的干扰素γ表达水平比CXCR5-CD8~+ T细胞显著提高。按照TCR刺激的模式,CXCR5+CD8~+ T细胞比CXCR5-CD8~+ T细胞有显著增强的增殖能力和更高的干扰素γ表达水平。TCR刺激的CXCR5+CD8~+T细胞也显示出CXCR5表达水平的逐渐下调。而CXCR5+CD8~+ T细胞也能通过自体B细胞增强IgG表达水平。结论:这些数据表明,胰高血糖素样肽-2和白介素35在结直肠癌患者的外周血中并无明显改变,CD8~+T细胞的比例略有上升。而CD8~+T细胞的亚型(CXCR5+CD8~+T细胞)在肿瘤微环境和肿瘤相关淋巴结中可以通过提高自身促炎因子的分泌以及促进体液免疫等发挥重要功能,并在结直肠癌中可能有抗肿瘤免疫的作用。本研究的意义及创新点:本课题明确了胰高血糖素样肽-2、白介素35和CD8~+ T细胞在溃疡性结肠炎以及结直肠癌的外周血中的改变,重点探明了白介素35在溃疡性结肠炎中的作用及机制,以及CD8~+T细胞的亚型(CXCR5+CD8~+T细胞)在结直肠癌中的功能及机理。为了解溃疡性结肠炎和结直肠癌这两类疾病的发病机制,并为开展以白介素35和CXCR5+CD8~+T细胞为靶点的新型免疫疗法提供理论依据。