动脉粥样硬化(atcherosclerosis,AS)的病理改变是以动脉内膜下酯质沉积,伴随平滑肌细胞增殖,纤维基质成分增加以及炎症反应为特征,并通过各种生长因子和活性代谢产物的影响和调节,刺激泡沫细胞形成,泡沫细胞的不断产生和堆积导致酯质条纹,并进一步变成纤维帽,逐步形成粥样硬化性斑块。核因子kB(nuclear factor kappaB,NF—κB)最先是从B淋巴细胞中发现的一种能与免疫球蛋白k轻链基因的kB序列特异性结合的核蛋白因子,现已知kB序列存在于多种基因的启动子和增强子中,NF-κB可与相关基因启动子或增强子特殊kB序列相结合,调控多种基因的表达,在体内具有非常重要的生物学功能。穿心莲内酯(Andrographolide,Andro)是二萜类化合物,但是目前国内外对于Andro抗炎作用的分子机制仍然知之甚少。本实验室先前的研究工作表明,Andro能够共价修饰处于还原状态的p50亚基上第62位半胱氨酸,因为该氨基酸位于NF-κB结合特定DNA的关键部位,因此Andro的共价结合阻断了NF-κB二聚体与靶基因特定DNA序列的结合,抑制炎症介质的活化。那么,在动脉粥样硬化形成过程中,穿心莲内酯是否也通过抑制NF-κB信号通路的活化,具有抑制动脉粥样硬化性状的重要作用?本研究旨在探索:(1)穿心莲内酯对NF-κB信号通路的调控作用;(2)穿心莲内酯对NF-κB信号通路的调控在动脉粥样硬化中的作用;(3)初步筛选靶向抑制NF-κB的小分子化合物本研究分为体外实验和体内实验两部分:一.体外实验。探寻穿心莲内酯对NF-κB信号通路的调控作用,主要包括:(一)采用E-selectin promoter-luciferase荧光素酶报告基因实验探明Andro是否能够抑制TNF-α引起的NF-κB活性。(二)用Andro预处理人脐静脉血管内皮细胞,再用酯多糖、佛波酯、TNF-α分别刺激细胞,然后通过流式细胞仪检测Andro药物干预是否可以下调活化的内皮细胞E-selectin的表达。(三)用Andro预处理小鼠的内皮细胞和巨噬细胞,再用酯多糖、佛波酯、肿瘤坏死因子分别刺激上述细胞,然后应用组织因子(TF)活性测定技术、蛋白免疫印记技术检测Andro是否可以起到下调活化的内皮细胞和白细胞组织因子表达的作用。(四)应用细胞转染和TF promoter-luciferase荧光素酶报告基因实验以探明Andro调控组织因子的表达是通过调控哪个靶位点实现的?二.体内实验。探索穿心莲内酯对NF-κB信号通路的调控在动脉粥样硬化中的作用,主要分解为下列实验:(一)用apoE基因缺陷型(apoE-/-)小鼠以高酯饲料诱导构建动脉粥样硬化动物模型。(二)利用油红O染色技术、H&E染色显示主动脉窦和主动脉血管内膜酯肪斑块的面积,血管壁的厚度,评价Andro治疗在动脉粥样硬化斑块酯质沉积中的作用。(三)全程监测小鼠体重,评价Andro治疗在物质代谢中的作用。(四)分别于药物治疗前后,禁食12小时后取血检测血浆TG,TC,HDL-C,LDL-C水平,评价Andro治疗对酯肪代谢的影响。(五)应用电泳迁移率变动实验(EMSA)分析Andro治疗对NF-κB活性的影响。(六)应用定量PCR技术分析Andro治疗对NF-κB下游与炎症,增殖及血栓相关靶基因E-selectin,VCAM-1,TF的mRNA转录的影响。(七)利用免疫组化和免疫灰度统计技术,观察穿心莲内酯治疗对E-selectin,VCAM-1,TF,fibrin表达的影响。本研究的实验数据结果表明Andro具有下列作用和功能:(1)抑制NF-κB与E-selectin启动子的结合,并且这种抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性;(2)抑制活化内皮细胞E-selectin的表达;(3)抑制活化内皮细胞和巨噬细胞组织因子(TF)的表达;(4)特异性地抑制组织因子启动子NF-κB位点;(5)减轻动脉粥样硬化斑块的酯质损伤;(6)不影响动脉粥样硬化小鼠的体重和血酯水平;(7)抑制动脉粥样硬化血管组织NF-κB的活性;(8)下调动脉粥样硬化血管组织E-selectin,VCAM-1,TF的mRNA水平;(9)下调E-selectin,VCAM-1,TF,fibrin的蛋白表达。从以上实验结果可以得出如下结论:本研究首次明确地证明了穿心莲内酯通过阻断NF-κB信号通路,抑制动脉粥样硬化的进程;并证实了NF-κB信号通路在贯穿动脉粥样硬化始终的炎症中以及在斑块的稳定性和血栓形成方面具重要作用;进而证实了穿心莲内酯特异性地抑制NF-κB与组织因子启动子TF-κB位点的结合;穿心莲内酯可以显著下调E-selectin、VCAM-1、TF、fibrin等与炎症、血栓密切相关基因的表达。本研究展示了靶向抑制NF-κB的小分子化合物穿心莲内酯经过进一步修饰有可能成为治疗血栓和炎症相关疾病的新药,特别是有望成为治疗动脉粥样硬化的新药。