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研究背景:大肠癌是一种对人类健康和生命威胁很大的恶性肿瘤,其发生与多种因素有关。大量遗传学和分子生物学研究表明,p73基因的异常表达与大肠癌的侵袭、转移和生长都有着密切的关系。ΔNp73基因是p73基因的一个亚型,缺乏NH2末端反式转录激活区域,是“缩短”了的p73基因。近年来的研究表明,ΔNp73基因作为p73基因的异构体,的确参与了肿瘤的发生机制,但ΔNp73基因在大肠癌中与抑癌基因之间的相互作用关系尚未明了,主要是:(1)ΔNp73基因在多种人类肿瘤中均很少有突变发生,但在大肠癌中却发生了突变;(2)ΔNp73基因在大肠癌中与周围正常组织比较表达明显增强;(3)ΔNp73基因敲除鼠并不发生自发性的肿瘤。因此,ΔNp73基因作为抑癌基因p53基因家族成员p73基因的异构体究竟是癌基因还是抑癌基因?至今尚未明了。虽然研究已表明,ΔNp73基因在大肠癌细胞中呈高表达,但ΔNp73基因的表达在大肠癌的发生、发展中的起着什么样的生物学作用机制?迄今有关文献鲜见报道。有鉴于此,这也正是本研究想要进一步阐明的课题。目的:研究ΔNp73基因的生物学特性;进一步阐明ΔNp73在人类大肠癌发生、发展中的作用机制;并探讨反义ΔNp73基因作为临床大肠癌基因治疗的新靶点的潜在价值。方法:将ΔNp73基因构建于真核表达质粒pcDNA3,通过脂质体基因转染的方法将外源性ΔNp73基因转染人类大肠癌细胞株LOVO,用G418筛选稳定表达ΔNp73基因的细胞克隆,RT-PCR和western blot对所筛选的细胞克隆进行鉴定。将筛选得到的稳定表达ΔNp73基因细胞株放大培养,观察ΔNp73基因对LOVO细胞株生长的影响。以转染ΔNp73基因后大肠癌细胞株的生长情况、凋亡率、侵袭性、肿瘤血管生长调节因子的变化作为切入点,利用MTT、流式细胞术、Boyden小室体外侵袭实验、肿瘤MVD测定以及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、western blot等多种实验室技术检测大肠癌细胞生物学指标及侵袭性的变化,并利用反义技术构建反义ΔNp73真核表达载体,探讨反义ΔNp73基因对大肠癌的治疗作用,并反证ΔNp73基因对大肠癌的侵袭性的影响。应用SPSS10.0统计软件进行统计分析。结果:将ΔNp73基因以脂质体法转染LOVO细胞后,经G418成功的筛选出稳定表达ΔNp73基因的细胞株。细胞生长曲线测定发现转染了ΔNp73基因后的LOVO细胞生长速度较未转染ΔNp73的LOVO细胞明显加快(P<0.01);流式细胞术检测结果提示表达ΔNp73的细胞株凋亡率降低,Boyden小室体外侵袭实验显示, LOVO-ΔNp73细胞穿膜数较空白对照组和LOVO-pcDNA3组增多,差异具有显著性(p<0.01)。与空白对照组相比, LOVO-ΔNp73细胞中VEGF表达较未转染ΔNp73基因的细胞明显增高(p<0.01)。RT-PCR半定量法检测LOVO细胞中的VEGFmRNA表达,发现ΔNp73基因显著增加了VEGFmRNA的表达(p<0.01);western blot半定量法检测VEGF蛋白表达,发现ΔNp73基因同样增强了LOVO细胞中VEGF蛋白表达水平(p<0.01)。在体内实验中,ΔNp73基因同样促进了裸鼠种植瘤的生长,并增加了肿瘤的MVD(p<0.05)。利用反义技术构建反义并转染LOVO细胞后,检测以上指标,结果提示肿瘤的生长受到抑制,侵袭性降低,血管生成减少,说明反义ΔNp73基因对大肠癌具有治疗作用,同时也反证了ΔNp73基因在大肠癌发病中所起的作用更类似一个癌基因。结论:ΔNp73基因在大肠癌的发生、发展中扮演了癌基因的角色。其作用机制是通过抑制细胞凋亡、促进大肠癌组织血管增生,从而促进了大肠癌细胞的增殖生长及增强了大肠癌的侵袭性。利用反义技术构建的反义ΔNp73基因,通过封闭ΔNp73基因的表达,可有效抑制大肠癌细胞的生长,促进大肠癌细胞的凋亡,可作为一种具有临床应用前景的大肠癌基因治疗的新靶点。