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转移作为结直肠癌发生发展的重要环节,与较差的预后密切相关。上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）作为调节转移的主要作用成分,可能和肿瘤细胞与肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）的相互作用相关。EMT的肿瘤细胞分泌大量的炎症介质来改变TME,而肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）作为TME中最丰富的免疫细胞,可以对TME中肿瘤细胞产生的各种因子产生应答。EMT的肿瘤细胞分泌介质可以极化TAMs到M2表型,从而反过来促进肿瘤的进展和转移。近期研究表明Notch通路参与调控肿瘤的EMT。NOTCH2作为Notch受体之一,在配体激活后诱导NOTCH2细胞内结构域的释放（N2ICD,Ad-NOTCH2）。然后N2ICD转位到细胞核,结合转录因子RBPJ,导致EMT相关靶基因的复杂活化。此外,Notch通路的激活能够介导GATA3表达诱导的IL-4分泌（重要的M2型TAMs极化因子）。这提示Notch通路在肿瘤EMT和巨噬细胞选择性极化中。然而,Notch通路是否促进CRC的EMT而影响TAMs极化尚不完全清楚。miR-195-5p作为miR-15/107家族的一员,在多种癌症中被广泛研究,被认为是抑制CRC增殖和增强放化疗敏感性的肿瘤抑制因子。我们已经证明miR-195-5p通过抑制YAP1抑制结直肠癌EMT,但是miR-195-5p介导的EMT如何调控CRC细胞因子分泌影响TAMs极化尚不清楚。基于上述基础,考虑到NOTCH2可能是m R-195-5p的靶点,我们大胆推测miR-195-5p/NOTCH2可能影响CRC的EMT状态,并调节结直肠癌中IL-4分泌,从而介导M2型TAMs极化。本课题包含以下三部分内容:第一部分:生物信息学分析Hsa-miR-195-5p的差异表达和通路及预后分析目的:通过生物信息学分析发现miR-195-5p在结直肠癌的表达差异并验证其预后价值。方法:使用来自结直肠癌患者的原发肿瘤组织和配对的相邻正常组织样本（paired adjacent normal tissue,PANT,相同患者）中的微小RNA测序数据来进行整合分析并鉴定其中显著性异常表达一致的miRNAs。通过TCGA数据库的TCGA-COAD（colon adenocarcinoma）生存数据验证miR-195-5p和NOTCH2的异常表达谱。结果:我们整合了大样本多中心的9张结直肠癌测序miRNA芯片,分析差异miRNAs的表达差异。同时使用公共的TCGA-COAD结直肠癌患者miR-195-5p和NOTCH2 m RNA表达数据发现了miR-195-5p和NOTCH2对结直肠癌患者预后呈负相关。运用GO分析和基因集合富集分析（GESA）,发现了P53、NOTCH和EMT相关信号通路。结论:我们整合了大样本多中心的9张结直肠癌测序miRNA芯片,发现了结直肠癌中低表达的miR-195-5p。TCGA-COAD结直肠癌患者生存数据验证了miR-195-5p和NOTCH2在预测结直肠癌患者预后中的价值。GO分析和基因集合富集分析（GESA）发现了P53、NOTCH和EMT相关信号通路,miR-195-5p和靶基因NOTCH2可能在结直肠癌发生发展转移过程中扮演着重要的角色。第二部分:miR-195-5p/NOTCH2调控结直肠癌细胞EMT状态机制的初步研究目的:通过体外体内实验验证miR-195-5p和NOTCH2的表达差异对结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移和EMT状态的影响,并探索miR-195-5p对靶基因NOTCH2的调节机制。方法:功能检测实验包括:Ed U免疫荧光、克隆形成、伤口愈合实验和Transwell实验,被用来检验miR-195-5p在人结直肠癌细胞中的抗癌作用。此外,使用RNA免疫沉淀（RIP）、RNA降解实验和双荧光素酶报告基因分析来确定miR-195-p对NOTCH2的调节机制。结果:结肠癌细胞增加miR-195-5p能明显抑制结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT化。敲低NOTCH2后,结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT也会受到显著抑制。过表达NOTCH2之后则效果相反。双荧光素酶报告实验发现miR-195-5p直接与NOTCH2 m RNA的3-UTR结合。而结合后的miR-195-5p并不影响m RNA的降解,而是形成沉默复合物转录后水平上抑制NOTCH2蛋白的表达。结论:miR-195-5p在原发性结直肠癌组织中的表达降低并且与总体生存率较低相关。miR-195-5p抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭等细胞能力,体内实验研究发现miR-195-5p能够抑制肿瘤的生长和EMT状态,抑制CTC的形成。miR-195-5p通过靶向NOTCH2 m RNA的3’-UTR端,在转录后水平直接调控NOTCH2蛋白的表达。第三部分:结直肠癌EMT状态调节肿瘤相关巨噬细胞选择性极化的机制探索目的:探索miR-195-5p/NOTCH2通路背后肿瘤EMT状态影响肿瘤相关巨噬细胞极化的潜在机制。方法:采用共培养、迁移和ELISA实验检验miR-195-5p转染的肿瘤细胞分泌的细胞因子在巨噬细胞募集和选择性极化中的作用。采用异种移植小鼠模型,在体内测定miR-195-5p在CRC致瘤性和TAMs极化中的作用。结果:降低肿瘤内的miR-195-5p的水平或过表达NOTCH2都可以诱导结直肠癌细胞发生EMT。而EMT状态下的的肿瘤细胞能表达高水平的GATA3和IL-4,从而导致体内外M2型TAMs招募和极化增加。沉默NOTCH2和抑制IL-4或中和IL-4都可以减少M2型TAMs。结论:这些结果表明不同的肿瘤细胞EMT状态会产生影响IL-4相关的M2型TAMs极化。miR-195-5p/NOTCH2在调控肿瘤细胞EMT的同时通过GATA3调控IL-4的表达,从而促进TAMs极化。