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目的:糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是主要的致盲性眼病,其发病机制尚未完全阐明,目前已知DR发生与外泌体相关,因此,我们运用定量蛋白质组学技术,分析增殖性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者血浆外泌体蛋白的表达变化情况,寻找PDR的生物学标记物,探寻PDR发生的机制和潜在治疗靶点。方法:第一部分:分离与鉴定血浆外泌体收集2017年-2018年天津医科大学眼科医院住院的PDR患者、糖尿病未发生眼底改变患者(以下简称为DM)和正常对照的血浆和临床信息,用差速离心法分离血浆来源外泌体,透射电镜观察外泌体的形态与大小,WB验证外泌体表面蛋白:CD9、CD63和CD81。分别测2ml血浆来源的微囊泡(micro vesical,MV)与外泌体的蛋白浓度,考马斯亮蓝染色实验分析外泌体、MV、不含胞外囊泡的血浆和血浆的蛋白分布情况。第二部分:定量蛋白组学分析血浆来源的外泌体分离三组患者血浆外泌体,将同组5个患者的外泌体混合成一份,取出部分做蛋白浓度测定,并使用同位素质量标签i TRAQ试剂标记样本,取等量的各标记样品等比例混合后进行液相色谱分馏,最后对样品进行LC-MS/MS检测及数据分析。筛选可信蛋白及差异蛋白,对差异蛋白进行基因注释分析。用ELISA验证差异蛋白在外泌体和微囊泡(micro vesical,MV)的表达情况;同时取PDR患者与正常对照(黄斑裂孔患者)的玻璃体进行ELISA验证。q-PCR和WB验证肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(tumor necrosis factorαinduced protein 8,TNFAIP8)在氧化应激模型的内皮细胞中表达情况。第三部分:4-羟基壬稀酸(4-HNE)刺激人视网膜微血管内皮细胞(h RMECs)的定量蛋白组学研究用4-HNE刺激h RMECs增殖,在体外构建内皮细胞氧化应激模型,提取细胞蛋白,使用非数据依赖的扫描方式进行质谱的定量检测。结果:1、参与质谱的患者临床信息分析:各组病人年龄、身高、体重、糖化血红蛋白、胆固醇、甘油三酯、肌酐、尿素氮和血压均无统计学差异。2、外泌体鉴定:外泌体电镜显示双层圆饼状、托盘样和茶杯样外观,直径在40-100nm之间。WB显示外泌体表达CD9、CD63和CD81。3、考马斯亮蓝染色结果显示:外泌体、MV、不含胞外囊泡血浆和血浆中的蛋白分布存在差异。外泌体蛋白含量在DR组和DM组较正常组低,差异具有统计学意义(ANOVA,P<0.05),MV的蛋白浓度在各组之间未见明显差异。4、血浆外泌体蛋白组学结果:外泌体蛋白组学共检测出856个蛋白,其中PDR较DM和正常升高的蛋白有5个,分别是TNFAIP8,蛋白S100-A8,蛋白S100-A9,锌指蛋白736和血浆型谷胱甘肽过氧化物酶,PDR较DM和正常降低的蛋白有173个,其中乳腺癌1型易感蛋白、神经颗粒素和巨核细胞和血小板抑制受体G6b下降最明显,发生DM时即降低的蛋白有34个。5、ELISA验证结果:TNFAIP8在PDR患者血浆外泌体中表达较DM和对照组升高(ANOVA,P<0.05),与质谱的趋势相同且具有统计学意义,玻璃体的ELISA结果显示PDR患者表达TNFAIP8水平较黄斑裂孔患者高,差异有统计学意义,(t检验,P<0.05)。MV中TNFAIP8的表达在三组没有差异;乳腺癌1型易感蛋白和神经颗粒素的ELISA结果显示各组外泌体蛋白表达没有差异。6、氧化应激模型构建:CCK-8实验显示不同4-HNE浓度对HRMECs活性影响不同,10μM 4-HNE对HRMECs增殖最明显(ANOVA,P<0.05)。7、氧化应激模型TNFAIP8表达:q-PCR和WB验证TNFAIP8在氧化应激模型中表达升高(t检验,P<0.05)。8、hRMECs定量蛋白组学质谱发现在氧化应激条件下多种蛋白发生变化,主要有抗氧化应激蛋白,ATP酶和程序性细胞凋亡因子4(t检验,P<0.05)。结论:1、成功分离出外泌体,血浆来源外泌体与血浆其他成分中的蛋白在组成和分布上存在差异,血浆含有血浆白蛋白干扰质谱的鉴定,因此,外泌体更适合定量蛋白组学分析。2、通过外泌体质谱分析,发现多种差异蛋白的表达。PDR患者血浆外泌体与玻璃体中TNFAIP8水平表达均是增加的,而血浆中MV的TNFAIP8表达未见差异。h RMECs在氧化应激时,TNFAIP8表达升高,可能在PDR的发病中可能发挥重要的作用,检测血浆外泌体的TNFAIP8水平可能作为检测PDR患者的生物学标记物。3、hRMECs受氧化应激时,引起氧化应激蛋白、ATP酶和血小板凝集相关蛋白上调,同时载脂蛋白A1和PDCD4等蛋白下调,说明参与氧化应激平衡和血小板凝集等多种蛋白共同调节内皮细胞的生长。