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研究背景膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤,目前临床上治疗方法主要有手术治疗、化疗及放疗,这些方法不仅价格昂贵,且易因反复用药产生耐药性和毒副作用。祖国医学对于膀胱肿瘤的研究起步较晚,但随着对中草药研究的进一步深入,中医药在防治膀胱肿瘤方面也有了显著的进步。中药治疗即可协同杀伤肿瘤,又有助于机体从整体水平调节免疫平衡状态,发挥扶正祛邪的功效。苦瓜是民间喜爱的食物,近年来科研工作者从苦瓜果实和种子中先后提纯获得多种具生物活性的有效成分,具有抗肿瘤、降血糖、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等多种功效,在这些生物活性物质中最引人注目的属核糖体失活蛋白(RIP)。MAP30是Ⅰ型RIP的一种,对多种肿瘤细胞均有抑制作用,但是关于MAP30对人膀胱癌细胞的生长抑制及凋亡影响的相关研究尚未见报道。研究目的本文通过分子克隆技术表达并纯化苦瓜重组MAP30蛋白,并通过咪唑兰(MTT)法、流式细胞仪检测分析MAP30对5637人膀胱肿瘤细胞增殖的抑制作用及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。研究方法(1)采用PCR技术从苦瓜基因组中扩增出MAP30基因片段,对其测序并构建重组表达载体pET-28a (+)-MAP30,转化至表达菌BL21(DE3),经IPTG诱导,通过镍胶柱纯化所表达的MAP30蛋白并分析计算其蛋白浓度。(2)将获得的MAP30蛋白加入处于对数生长期的人膀胱癌5637细胞共培养,使用咪唑兰(MTT)法检测MAP30蛋白对人膀胱癌细胞增殖的抑制作用。(3)将获得的MAP30蛋白加入处于对数生长期的人膀胱癌5637细胞共培养,使用流式细胞仪检测分析MAP30蛋白诱导人膀胱癌细胞的凋亡作用。研究结果(1)制备苦瓜基因组DNA并以此为模板,通过PCR技术成功扩增出MAP30基因,与NCBI公布的序列比较同源性100%,；成功构建了pET-28a (+)-MAP30原核表达载体,在BL21(DE3)中实现了可溶性表达获得重组MAP蛋白,大小约34KDa,与理论值相符。镍胶柱纯化MAP30蛋白,BEA法计算蛋白浓度为434pg/μl,(2)MTT实验发现,100μl/L、200μl/mL及400μl/mL MAP30对5637膀胱癌细胞作用24h或48h后,各实验组对膀胱癌细胞增殖的抑制作用均明显高于对照组,各组间比较P<0.05。(3)流式细胞仪检测发现,200μl/mL及400μl/mL MAP30蛋白作用膀胱癌细胞24h或48h后,其膀胱癌细胞凋亡率均高于对照组；MAP30作用48h后细胞凋亡百分率高于24h,400μl/mL剂量的MAP30作用后凋亡率明显多于200μl/mLo研究结论(1)本研究成功构建了pET-28a (+)-MAP30原核表达载体,并获得重组MAP蛋白。(2)MAP30蛋白可抑制5637人膀胱癌细胞增殖,其效应作用呈剂量、时间依赖性。(3)MAP30蛋白可诱导5637人膀胱癌细胞凋亡,其效应作用呈剂量、时间依赖性。