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百合(Lilium)作为世界著名切花之一,在中国切花市场占据着不可忽视的市场份额,但是想要占领世界花卉产业的高地,还需不断创新,培育出蓝色等稀有、奇特花色的新品种。植物花色的形成与花色素种类和含量密切相关,而二氢黄酮醇4-还原酶DFR基因作为蓝色翠雀素花色苷合成途径中的关键基因之一,由于其对底物的选择具有特异性,想要获得稳定的百合蓝色品种,就要先下调内源DFR基因的表达能力。所以,本研究通过克隆百合中的DFR基因,对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析,并构建带有内含子的发卡结构的RNAi植物表达载体,农杆菌介导转化百合和烟草,初步鉴定其功能,以求引起其内源DFR基因沉默,获得花色淡化或白色花的转基因植株。主要研究成果如下：1.克隆了百合LoDFR1和LoDFR2基因。提取‘索邦’百合花苞总RNA,反转录合成cDNA第一链,PCR扩增得到两个基因,命名为LoDFR1和LoDFR2,两者均包含1134bp的完整开放阅读框(ORF),编码377个氨基酸,但有21个碱基的差异,相似性达98.2%。2.进行了LoDFR1和LoDFR2基因的生物信息学分析。预测LoDFR1和LoDFR2编码的蛋白质相对分子量分别为42.7 kDa和42.6 kDa,理论等电点分别为5.87和6.25：含量最丰富的氨基酸均为Lys、11e、Leu、Asp和Ser,均不含有Pyl和Sec,都属于稳定类蛋白,并且其N-末端存在一个21个氨基酸残基组成的高度保守的NADP结合区"VTGASGYVGSWLVMKLLQYGY",由26个氨基酸构成的底物特异结合区域"TVNVQEHQMSEYDESSWSDDDFCRRV",以及第134位决定结合底物为DHK或者为DHQ的N(天冬酰胺)。LoDFRl、LoDFR2基因与同为东方百合的LhDFRl、LhDFR2、 LsDFR基因同源性最高,编码的蛋白质亲缘关系最近,其次是同为百合科的油点草TsDFR和郁金香TfDFR,在系统进化树分析中还发现单子叶植物和双子叶植物的DFR分别聚类。3.初步鉴定了LoDFR1和LoDFR2基因的功能。首先,从LoDFR1和LoDFR2基因全长cDNA中分别扩增克隆得到正、反向RNAi目的片段(350bp),构建重组子pMD18-Tintron作为中间载体,再将LoDFR1和LoDFR2基因的正反向RNAi目的片段切下分别连接到中间载体intron两端,最终将RNAi target(正向RNAi目的片段+intron+反向RNAi目的片段)连接到表达载体pCAMBIA1301-35S-int-T7上,成功构建百合DFR基因发卡结构的植物表达载体pCA-LoDFR1、pCA-LoDFR2;然后,确定了百合最佳诱愈材料为小鳞片或小叶柄,抗性愈伤筛选及抗性生根筛选的Kan最佳浓度均为1 OOmg/L,农杆菌介导法将pCA-LoDFR1载体转化百合和烟草,转化率分别为7.1%和15.6%,pCA-LoDFR1在烟草花药、花瓣、花柱、果实及种子等内高强度表达；最后,转基因百合植株由于生长周期较长,暂未观察到与对照植株的差异,而转基因烟草植株在转化初期叶片形态发生变化,细长且呈现淡绿色,开花时间推迟2-3天,花色明显淡化,花冠檐由粉色变为浅粉色。可判定RNAi干涉片段已整合进入烟草基因组,对花色表现产生干涉效应,且DFR基因对于烟草叶片和花的发育均有一定的调控作用。