研究背景：乳腺癌是最常见的上皮细胞肿瘤之一,发病率及死亡率均高居女性恶性肿瘤的首位,严重危害女性的健康,已成为全球关注的健康问题。过去20年,在大多数国家,乳腺癌发病率持续增长。据世界卫生组织(World Health Organization), WHO)统计,全世界女性乳腺癌新诊断病例约138.4万例,死亡45.9万例。因此,乳腺癌已经成为危害妇女健康的最大威胁之一。乳腺癌的危害及其发展趋势受到社会经济发展、环境和生活方式的改变以及人口老龄化程度等诸多因素的影响。乳腺癌细胞的浸润和转移是影响乳腺癌患者预后的关键因素,而肿瘤的发生和转移又与肿瘤细胞所处的微环境有密切的关系。肿瘤微环境是一个复杂的综合系统,是肿瘤在其发生发展过程中所处的内环境,由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞等共同组成,它有别于正常细胞与其周围组织所形成的微环境。组织缺氧和酸中毒、间质高压形成,大量生长因子和蛋白水解酶的产生及免疫炎性反应等构成了肿瘤组织代谢环境的生物学特征,这种特性对于调控肿瘤的发生和发展、增殖、侵袭、迁移、黏附能力及新生血管的形成都具有重要的影响,而缺氧作为实质性肿瘤物理微环境之一,对肿瘤的生物学特性有着关键性的影响。实质肿瘤的生长速率超过周围血管提供生长因子,营养,氧气以及带走肿瘤本身产生的代谢废物的能力时,这种供给和需要的不平衡将会导致肿瘤区域缺氧,低糖水平和低pH。临床和实验等证据表明缺氧微环境是增加肿瘤转移能力的重要因素之一。肿瘤细胞在缺氧的微环境中有一套适应和存活机制,这其中缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)发挥了重要作用。HIF-1是能使大部分生物在缺氧状态下维持生存状态的一种转录激活因子。研究表明HIF-1调控肿瘤在缺氧状态下的能量代谢、血管生成、浸润转移等。现在已发现HIF有一个大家族,包括HIF-1,HIF-2和HIF-3。其中研究最多的,也是调节肿瘤细胞存活和恶性进程最重要的HIF成员为HIF-1。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转化的现象,其定义为具有极性、紧密连接特性的上皮细胞失去原有极性和细胞形态,经过细胞骨架重塑换成独立的、细胞间连接松散、具有移行能力、并能侵入细胞外基质的间质细胞的过程。EMT的概念最早见于发育生物学,主要参与胚胎的发育、组织重建、创伤愈合、心瓣膜和颅面结构以及肌肉骨骼系统的形成,同时与多种慢性疾病(如肾纤维化)的发病机制密切相关。近年来研究还发现EMT过程与肿瘤细胞的生长、浸润及转移密切相关。参与调控肿瘤细胞EMT过程的信号通路及相关基因的研究日益受到重视,成为肿瘤研究的热点。钙连接素是上皮组织中的一类依赖Ca2+的细胞间跨膜粘连糖蛋白分子,主要参与细胞间的连接,分为E-钙黏素(E-cadherin)、P-钙黏素(P-cadherin)和N-钙黏素(N-cadherin),其中E-cadherin和N-cadherin对肿瘤侵袭转移的影响最为重要,同时也是EMT的关键分子。上皮型钙黏蛋白即E-cadherin,含细胞外区、跨膜区以及细胞质区三部分,是一次跨膜糖蛋白。Ca2+结合区位于E-cadherin胞外的重复单元之间,E-cadherin胞质内部分别可以与α、β或γ连环素(catenin)形成复合物,首先新合成的E-cadherin与β或γ连环素结合,在从胞质转运至胞膜的同时,E-cadherin加工装饰并成熟。经β或Y连环素作为中介,可以与α连环素形成至少两种E-cadherin/catenin复合物,最后通过与α连环素结合的肌动蛋白牵引而到达相邻细胞连接处,聚集成纤维状。E-cadherin普遍存在于各类上皮细胞中,可以介导同型细胞间连接,从而维持正常上皮细胞形态、细胞极性及组织结构完整性。在乳腺癌临床病理类型中,分级较高的浸润性导管癌、三阴性乳腺癌、基底细胞样癌浸润和转移的几率较高,预后不良。之所以上述乳腺癌类型浸润转移较多,主要是这些类型的癌细胞经历了上皮细胞向间充质细胞转化的过程,从而获得较强的活力和侵袭能力,具有这种能力的细胞,表型通常会发生变化,而其中最重要的标志性变化是上皮细胞的E-cadherin蛋白表达减少或丢失和间质细胞的N-cadherin蛋白表达出现。有研究表明HIF可能会通过作用于Notch信号通路导致E-cadherin水平的降低,从而促进肿瘤的迁移。然而在影响肿瘤发生发展的分子机制研究方面,缺氧是否诱导乳腺癌细胞的上皮间充质转化进而影响乳腺癌侵袭转移还鲜有文献报道。体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境,该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。二维(2D)细胞培养是目前体外研究恶性肿瘤的生长、分化、侵袭、转移、凋亡及筛选和检测抗肿瘤药物的常用方法,尽管在肿瘤体外研究中取得了一些进展,但是该体系缺乏真实肿瘤组织的三维微环境,不能很好的模拟体内实体肿瘤的微环境,如缺少细胞外基质的支持,贴壁生长的细胞失去了原有形态特征及生长分化能力；缺乏三维立体构型,在研究细胞与细胞、细胞与微环境相互作用,尤其是研究肿瘤细胞在三维环境中的组织结构与浸润转移等方面存在严重的局限性,同时在抗肿瘤药物筛选和检测中易造成假阳性,所得的研究结果并不能完全体现体内实体肿瘤的真实性。因此这就要求我们有必要寻找一种更好的研究方法来代替二维(two-dimension,2D)培养系统。不同于传统的二维化单层细胞培养,三维细胞培养技术(three-dimensional cell culture,TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。TDCC模型是一个更适合于用来研究基因功能与生物机体调节相关通路的理想模型,促进了癌症生物学研究方法的转变,有助于发现新的肿瘤治疗靶点。近年来许多组织工程方法构建的三维(three-dimension,3D)体外肿瘤模型正在用以模拟体内实体肿瘤微环境来研究肿瘤发生发展的分子机制及进行体外肿瘤药物渗透研究。此外,实体瘤组织内存在不同表型的肿瘤细胞,包括增殖细胞、非增殖细胞以及坏死细胞。TDCC技术所形成的三维多细胞肿瘤球体模型中的细胞分为表层细胞和深部细胞,氧供充分的细胞和缺氧的细胞等,因而这种模型能更好地模拟体内肿瘤微环境中的缺氧及pH的改变,更加接近体内完整的肿瘤组织。因此,3D体外组织构建就为我们研究肿瘤提供了一种比2D培养系统更真实的可靠选择。在三维模型构建中,生物材料是其中的一个至关重要的环节。目前生物材料可以分为天然和人工合成两大类。体内丰富的胶原、基质胶、以及细胞外基质,是最佳天然类生物材料。随着近代无机化学和高分子化学的迅猛发展,人工合成类生物材料进展的也比较迅速。在以往的研究中,水凝胶、印度蚕丝蛋白、Ⅰ型胶原蛋白等生物材料推动了三维组织构建方法研究的发展。胶原等天然材料由于来源于动物或人体,具有优良的生物相容性,但是其最大缺点是材料中存在着不同批次产品之间的生物性能差异,影响实验的可重复性,且降解速度较快,力学强度较差。水凝胶是非常合适的递送治疗性干细胞和细胞调节因子的人工合成的细胞外基质,同时也可以利用水凝胶与种子细胞构建各种工程化组织。合成水凝胶具有良好的物化特性,具有很好的生物相容性,并且可以按照不同损伤组织的再生过程程序化调控材料的合成过程。水凝胶还能够按照特殊的需求,通过调节化学组成结构、合成过程以及交联手段设计具有特定力学性能和特定分子信号的细胞外基质。然而,水凝胶也存在生物降解性能差、细胞黏附性能差等缺点,限制了它在组织构建中的应用。此外,生物材料的大小和尺度也是必须考虑的因素。一般来说,天然材料以及合成类高分子材料其直径和孔隙尺寸一般是微米级,不能够为细胞提供真正的三维环境。理想的三维支架材料应具备以下特点：材料的结构尺寸应保证细胞处在真正的三维环境中；材料可设计性强；材料应具有材料制备过程经济,可重复生产,生物安全性、生理条件下良好的相容性等。近年来应用广泛的层层自组装技术(LBL)则是个比较不错的选择。本实验室已在体外成功构建了壳聚糖3D体外肿瘤模型,在此基础上本课题采用明胶-海藻酸盐-壳聚糖作为自组装材料构建了乳腺癌的体外三维培养模型,探讨其对肿瘤缺氧状态的模拟情况。本课题第二部分将传统二维培养的细胞和三维培养模型接种于裸鼠体内,从动物实验水平探讨三维肿瘤模型相比于二维培养模型的优势所在,为进一步研究乳腺癌的生物学特性以及进行药物疗效评价提供一定的理论与实验基础。目的：1.利用层层自组装(Layer by Layer, LBL)技术制备较为理想的明胶-海藻酸钠-壳聚糖多层纳米膜,并与人乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养,检测其表征。应用3D体外培养体系简单模拟体内肿瘤细胞生长的缺氧微环境,为进一步研究缺氧条件下EMT机制对肿瘤发生发展的作用提供更优越的平台。2.选用裸鼠为实验对象,比较传统二维培养条件和三维肿瘤模型下乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤以及迁移情况,初步探讨三维培养模型相比于二维培养模型的优势,为进一步开展对乳腺癌的发生发展以及侵袭性转移的研究提供一定的理论与实验基础。方法：1.细胞培养。购买人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,常规复苏后用含10%FBS、100U/ml的青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基培养于25cm2培养瓶中,37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。2-3d传代,传代的细胞分成两组,一组用于传统二维培养,一组与自组装纳米膜混合共培养,构建3D肿瘤组织模型。2.裸鼠的饲养。从南方医科大学购买BALB/c-nu裸鼠,精心饲养,观察裸鼠精神状态、活动能力等。所有的动物实验都遵守南方医科大学动物实验中心指定的动物相关制度。3.3D肿瘤组织模型的构建。人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞以1×106/cm2接种密度接种于75cm2培养瓶中,37℃、5%C02的细胞培养箱中培养。隔天换液待细胞融合至80%-90%后用PBS洗两遍,用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶液消化,于镜下观察消化情况,待70%细胞变圆脱下时,用完全培养基终止消化,轻轻吹打瓶底细胞,收集细胞悬液,800rmp,5min,离心去上清液,调整细胞数在1×107。收集到的细胞均匀分散到已经预热的1%明胶溶液中(7ml),细胞材料作用十分钟后,1000rmp,5min,离心去除多余的明胶溶液,此时细胞表面沉积一层阳离子型聚电解质薄膜。然后将预热的0.1%海藻酸钠溶液(7ml)与聚电解质薄膜反应10分钟,1000rmp,5min,离心去除多余的海藻酸钠溶液,得到表面是阴离子的聚电解质薄膜。上述两个步骤重复三次,最后可得到包裹有大量乳腺癌细胞的聚阴离子多层纳米膜。将0.2%壳聚糖溶液(7m1)与等体积RPMI-1640培养基充分混合,pH值调至6.7左右,与聚阴离子多层纳米膜反应10分钟,1000rmp,5min,离心去除多余的壳聚糖溶液,从而形成聚阳离子纳米膜。培养基轻轻重悬纳米膜,后置于六孔板中,37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养,每天换液。培养一天后,将纳米膜转移至另一个孔继续培养。正常二维培养细胞作为对照。取出复合MDA-MB-231乳腺癌细胞的聚电解质纳米膜,PBS清洗三次,予活死染色试剂盒观察纳米膜上细胞的存活状况。2.5%戊二醛固定后,扫描电镜和透射电镜分别观察纳米膜表面以及内部的细胞生长状况。4%多聚甲醛常温固定后冰冻切片做活死染色检测纳米膜内部细胞的活性,免疫荧光检测纳米膜上肿瘤细胞HIF的表达情况。4.裸鼠肿瘤的接种。将培养四天的二维培养的细胞(cells in 2D culture)以及从纳米膜上迁移出的细胞(cells migrated from 3D culture)用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶液消化后,收集细胞悬液,分别加入等体积的PBS液和Matrigel胶重悬,充分混匀,用1ml注射器抽取100ul(细胞总数：5×106),左手拇指食指固定裸鼠头部,无名指及小指固定尾巴,右手将细胞悬液注射于裸鼠右裸鼠右胁助部皮下,分别得到移植有二维培养细胞的裸鼠(2D组,5只)和移植有纳米膜上迁出细胞的裸鼠(3Dm,5只)。纳米膜经PBS洗3次,切开裸鼠右侧胸壁皮肤约1.0cm,暴露脂肪垫,将肿瘤球移植入皮下间隙,缝合切口,得到移植有3D肿瘤球的裸鼠(3Di,5只)。每天观察其存活情况、精神活动状态、称体重。每天观察其成瘤状况。肿瘤长出后,隔天观察肿瘤形态,测量裸鼠肿瘤的长径和长径垂直的短径,计算其体积并绘制肿瘤生长曲线。50天后,处死裸鼠,称重肿瘤组织。5.裸鼠肿瘤细胞上皮间充质转化的检测。离断颈髓法将裸鼠处死,剥离裸鼠肿瘤组织,保留其包膜,将其置于4%多聚甲醛中固定约24h,冰冻切片后予N-cadherin、E-cadherin蛋白免疫荧光检测。6.统计学分析。统计分析采用SPSS13.0统计软件完成,结果用均值±标准差(x±s)来表示。两独立样本均数比较采用独立样本t检验分析,采用Equality of Variances方法(方差齐)或者Satterthwaite近似t检验方法(方差不齐),p<0.05表示差异有统计学意义。组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐性的组间比较采用Tukey法,方差不齐的组间比较采用Dunnett’s T3法,p<0.05认为差异有统计学意义。结果：1.通过LBL法构建的多层纳米膜结构呈白色透明状,表面含有大量的细胞,生物相容性好,随着培养时间延长,肿瘤细胞不断从纳米膜中爬出。2.扫描电镜结果显示：由纳米膜所形成的多细胞肿瘤球呈多孔性的三维网络结构,网间隙较小,这有利于水分,营养物质及氧气渗透;肿瘤球表面细胞生长良好,细胞与细胞,细胞与细胞外基质之间相互作用,形成肿瘤细胞生长的3D立体环境,组织表面的肿瘤细胞比较理想的粘附在3D材料支架上。3.纳米膜表面的活死染色结果显示肿瘤球表面可见少量死亡细胞(红色),肿瘤球呈三维立体结构,生物相容性好。4.纳米膜冰冻切片后的活死染色结果可见肿瘤球表面活细胞较多(绿色),而肿瘤球内部则见到大量的死细胞(红色)。免疫荧光检测HIF蛋白表达(568nm激发红光),CD47蛋白大量表达(488nm激发绿光),DAPI染核(蓝色),可见大量细胞核碎片,边缘不清晰,细胞发生凋亡。正常二维培养组细胞未见HIF表达,DAPI染核(蓝色)清晰。透射电镜结果显示肿瘤球内部细胞出现坏死,脂滴形成。5.2D组、3Dm组、3Di组接种肿瘤后第10天,2D组和3Dm组5只裸鼠腋下均出现肿瘤,体积分别为277.86±50.00mm3,72.97±88mm3.2D组和3Dm组肿瘤体积随着时间不断的增长,2D组裸鼠的肿瘤体积明显大于3Dm组裸鼠肿瘤体积,且肿瘤的增长速度快于3Dm组肿瘤。在肿瘤接种后第21天,2D组裸鼠肿瘤体积为1685.87±258.09mm3,3Dm组裸鼠肿瘤体积为486.33±373.98mm3,3Dm组与2D组肿瘤体积有显著性差异(p<0.05)。肿瘤移植后第29天,2D组裸鼠肿瘤体积为2160.62±17.19mm3,3Dm组裸鼠肿瘤体积为695.90±525.75mm3,3Dm组肿瘤体积明显较2D组肿瘤体积小,且有统计学意义(p<0.01)。接种后第40天,2D组裸鼠肿瘤体积为3561.47±617.42mm3,3Dm组裸鼠肿瘤体积为939.15±706.74mm3,3Dm组肿瘤体积明显小于2D组肿瘤体积,且有统计学意义(p<0.01)。接种后26天,3Di组5只裸鼠腋下出现肿瘤,肿瘤很小,不易测量,且生长缓慢。2D组裸鼠肿瘤体积生长速度快,肿瘤出现8天后,裸鼠肿瘤表面出现溃疡坏死。3Dm组有一只裸鼠出现溃疡,而3Di组裸鼠肿瘤表面均未出现溃疡。接种后50天,2D组其中一只裸鼠死亡,实验终止。6.接种肿瘤后,三组裸鼠精神状态及活动能力一直很好,未见明显活动异常。2D组裸鼠肿瘤体积后期增长迅速,状态逐渐衰弱。在肿瘤接种50天时,2D组其中一直裸鼠出现死亡,实验终止。取材后,2D组、3Dm裸鼠三只裸鼠均形成具有完整包膜的肿瘤组织,肿瘤重量分别为0.456±0.052g、0.102±0.822g。3Di组裸鼠有一只形成具有完整包膜的肿瘤组织,肿瘤重量为0.031±0.010g。3Dm组和3Di组肿瘤肿瘤无显著差异(p>0.05),3Dm组相对于2D组有显著差异(p<0.05),同时3Di组裸鼠肿瘤重量也显著小于2D组(p<0.01)。此外,3Di组另外两只裸鼠皮下出现肿瘤样白色组织,未形成完整包膜。7.免疫荧光检测2D组、3Dm组、3Di组肿瘤组织N-cadherin蛋白(568nm激发绿光)和E-cadherin蛋白(488nm激发绿光)表达情况,结果示：2D组N-cadherin蛋白表达强阳性(红色),DAPI染核(蓝色),细胞异型性明显,可见细胞核碎片,核多呈空泡状。3Dmm组E-cadherin蛋白强阳性(绿色),DAPI染核(蓝色)清晰；3Di组肿瘤组织N-cadherin蛋白阳性(红色),E-cadherin蛋白阳性(绿色),DAPI染核(蓝色)未见异常；3Di组肿瘤样白色组织E-cadherin蛋白大量表达(绿色),DAPI染核(蓝色)清晰。结论：1.基于明胶-海藻酸钠-壳聚糖自组装制备的3D体外肿瘤模型具有良好的生物相容性,再现细胞与细胞,细胞与基质之间的相互作用,为细胞的生长提供了一个和体内近乎相似的三维立体的空间结构,并且其可简单模拟体内实体肿瘤微环境中的缺氧状况,更加接近体内完整的肿瘤组织。2.在动物水平,3D肿瘤模型不仅模拟了缺氧介导的上皮间充质转化,进而促发的肿瘤侵袭能力增强的过程,而且其所构建的休眠微环境限制了细胞的迅速迁移,起到了休眠屏障的作用,模拟了肿瘤生长所必经的潜伏期阶段,真实再现了体内肿瘤生长的过程,这也更利于我们对乳腺癌发生、发展、转移的研究。