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益生菌广泛用于调节动物肠道健康,乳酸杆菌为应用最早、研究最多的益生菌菌种之一。乳酸杆菌通过其不同成分能够介导动物胃肠道免疫调节作用,发挥益生效应,然而其免疫调节机制仍不明了。鉴于此,阐明乳酸杆菌具有怎么样的肠道免疫调节功能,解析其免疫调节的信号通路及其关键靶点,将为益生菌免疫调节功能的开发提供科学依据,对筛选和培育高效乳酸杆菌等益生菌具有重要的实践意义。本试验旨在以公认的标准益生乳酸杆菌——鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)为代表,同时分离并获得LGG不同成分(表面蛋白SLP、胞外多糖EPS、基因组DNA以及人工合成的未甲基化CpG ODN),分析LGG及其不同成分对人工致敏体外培养肠上皮细胞的免疫调节效应和免疫保护作用,查明乳酸杆菌对小肠上皮细胞信号通路的调控作用,解析乳酸杆菌实现免疫调节作用的信号通路靶点,阐明乳酸杆菌发挥肠道免疫调控作用的分子机制。与此同时,以LGG作为参考菌株,构建小鼠炎症模型研究猪源乳酸杆菌(高粘附菌株Lactobacillus reuteri ZJ617和低粘附菌株Lactobacillus reuteri ZJ615)对肠道的免疫调节作用,分析乳酸杆菌介导动物肠道免疫调节作用的机制。本研究主要采用大肠杆菌LPS分别诱导猪小肠上皮细胞系IPEC-J2细胞和C57BL/6小鼠产生免疫反应,构建炎症模型以评定乳酸杆菌的免疫调节作用。通过构建猪小肠上皮细胞系IPEC-J2细胞脂多糖LPS炎症模型,采用2×107 CFU/mL LGG或从LGG中分离纯化获得的不同成分(表面蛋白SLP、基因组DNA、胞外多糖EPS以及人工合成的未甲基化CpG ODN序列),分别预处理IPEC-J2细胞(1×106细胞/孔)4小时,再以脂多糖LPS刺激细胞。同时,通过构建C57BL/6小鼠LPS炎症模型,连续灌胃108 CFU/mL乳酸杆菌(LGG、ZJ617或ZJ615)一周后,腹腔注射LPS诱发炎症。采用qRT-PCR技术检测IPEC-J2细胞和小鼠肠道组织致炎性细胞因子以及Toll样受体(TLR)的mRNA水平。采用Western-blot技术、免疫组化和免疫荧光技术分别检测IPEC-J2细胞和小鼠肠道组织中炎症相关信号通路(NF-κB信号通路和MAPK信号通路)主要靶点蛋白的表达水平。研究结果表明:1)与单纯LPS刺激猪肠上皮IPEC-J2细胞相比,LGG预处理IPEC-J2细胞后显著降低由LPS诱导的细胞致炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和TLR受体TLR2、TLR4、TLR9的mRNA水平;细胞信号通路分子p38MAPK、ERK1/2和NF-κBp65的磷酸化水平显著降低,而I-κBα表达量显著上升(P<0.05)。2)与单纯LPS刺激IPEC-J2细胞相比,LGG表面蛋白SLP和胞外多糖EPS预处理IPEC-J2细胞后能够显著降低由LPS诱导的细胞致炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和TLR受体TLR2、TLR4、TLR9的mRNA水平;细胞信号通路分子p38MAPK和NF-κBp65磷酸化水平显著降低,而I-κBα表达量显著上升(P<0.05)。3)与单纯LPS刺激IPEC-J2细胞相比,LGG未甲基化的CpG ODN预处理IPEC-J2细胞能够显著升高由LPS诱导的细胞致炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α水平和TLR受体TLR2、TLR4、TLR9的mRNA水平;信号通路分子p38MAPK、ERK1/2磷酸化水平与单纯LPS刺激细胞相比没有显著差异(P<0.05)。4)与单纯LPS刺激未经乳酸杆菌灌胃小鼠相比,LGG和低粘附力乳酸杆菌ZJ615连续灌胃一周的小鼠接受LPS刺激后,其肠道组织中炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和TLR受体TLR2、TLR4、TLR9的mRNA水平显著下降;肠道组织中信号通路分子p38MAPK、ERK1/2和NF-κBp65的磷酸化水平显著降低,而I-κBα表达量显著上升(P<0.05)。5)与单纯LPS刺激未经乳酸杆菌灌胃小鼠相比,高粘附力乳酸杆菌ZJ617连续灌胃一周的小鼠接受LPS刺激后,其肠道组织中炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和TLR受体TLR2、TLR4、TLR9的mRNA水平显著升高,同时小鼠肠道组织中抗炎性细胞因子IL-10的mRNA水平显著升高;肠道组织中信号通路分子I-κBα表达量显著下降(P<0.05)。研究结论:由此可见,鼠李糖乳酸杆菌LGG主要通过调节小肠上皮细胞Toll样受体mRNA水平,抑制细胞MAPK和NF-κB信号通路激活,降低LPS诱导的炎性细胞因子mRNA水平,从而介导肠道免疫调节作用。鼠李糖乳酸杆菌LGG成分表面蛋白SLP、胞外多糖EPS以及未甲基化CpG ODN对LPS诱导的肠上皮细胞具有免疫调控作用,其中未甲基化CpG ODN具有免疫刺激作用。不同粘附力乳酸杆菌肠道免疫调节效应存在差异,其中低粘附力乳酸杆菌ZJ615介导肠道免疫调控作用与LGG相似。