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溶杆菌属由Christensen和Cook于1978年建立新属,属于黄单胞科,γ-变形菌门。该属细菌具有基因组DNAG+C%含量高、无鞭毛、产生多种次生代谢抗菌物质等特点,且在自然环境中广泛存在。近年来,随着越来越多的抗菌活性物质从溶杆菌中被分离鉴定出来,溶杆菌作为新型抗生素的重要来源逐渐引起科研工作者的广泛重视。产酶溶杆菌OH11分离自辣椒根际土壤,对多种病原真菌、卵菌、细菌具有良好的拮抗作用。HSAF(Heat Stable Anti-fungal Factor)是分离自产酶溶杆菌OH11中的热稳定性抗真菌因子,能够通过干扰丝状真菌鞘脂合成从而抑制靶标真菌的生长。HSAF的生物合成基因簇也已被报道,它由一个杂合的PKS/NRPS负责合成。随着OH11全基因组测序的完成,产酶溶杆菌成为溶杆菌中被研究的最为深入的一个种。环二鸟苷酸c-di-GMP广泛存在于细菌中,被归为第二信使的一种,能够调控细菌一系列重要的生理生化功能,如胞外多糖合成、生物膜形成、运动性和致病性等。c-di-GMP在细菌体内由含有GGDEF/GGEEF结构域的鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)负责合成,由具有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)降解。c-di-GMP并不能直接调控靶靶标基因的表达,而是通过结合特有的受体实现对某些功能的调控。尽管过去30年的研究已明确c-di-GMP通过不同作用方式和机制调控细菌的多种生理生化功能,但关于该小分子调控细菌次级代谢产物的研究较少且不系统,仍处在起步阶段。在本研究中,我们以能够产生抗真菌因子HSAF的产酶溶杆菌OH 11为研究对象,首先通过异源表达已知的DGC和PDE,初步明确了细胞中c-di-GMP浓度的改变影响HSAF的产量。进一步利用生物信息学分析找到了产酶溶杆菌OH11中26个c-di-GMP的代谢酶,其中14个蛋白含有GGDEF/GGEEF结构域,6个蛋白同时含有GGDEF/GGEEF和EAL结构域,1个蛋白含有EAL结构域,5个蛋白含有HD-GYP结构域。通过基因敲除、过表达文库的构建结合HSAF的定量提取检测,我们定位了一系列对HSAF合成有调控功能的蛋白。其中的LchP是一个既含有GGDEF结构域又含有EAL结构域,同时在其N端拥有3种不同的信号感应结构域的蛋白。转录组数据揭示LchP蛋白能够特异性调控HSAF的生物合成。虽然实验证明该蛋白通过其PDE酶活对HSAF的生物合成进行调控,但其负责合成c-di-GMP的GGDEF酶活关键位点在这个过程中也必不可少。进一步研究发现c-di-GMP的合成酶LchD可以和LchP形成物理互作关系,协同调控HSAF的生物合成。除此之外,我们也找到了 LchP下游c-di-GMP的受体蛋白——转录因子Clp,并且Clp可以分别与LchP和LchD形成物理互作关系。体外生化酶活实验揭示Clp与LchP互作可以促进LchP的PDE酶活功能。调控机制研究揭示c-di-GMP浓度影响受体蛋白转录因子Clp与HSAF合成关键基因laf8启动子区的结合,从而最终影响HSAF的生物合成。本研究除揭示了完整的LchP/LchD-Clp-c-di-GMP-HSAF信号通路,我们还发现c-di-GMP受体蛋白Clp也位于另外一条含有c-di-GMP降解酶RpfG的信号通路中,即群体感应信号分子DSF及双组分系统相关的RpfF-RpfC/RpfG--c-di-GMP-HSAF的信号通路中,但关于这两条通路交叉的生物学意义还有待研究。本论文是首次对溶杆菌的c-di-GMP进行系统研究,鉴定了产酶溶杆菌OH11中的全部c-di-GMP代谢酶类并初步明确了每个蛋白与HSAF生物合成的关系。研究中所发现的LchP/LchD-c-di-GMP-Clp调控HSAF生物合成的信号通路也填补了c-di-GMP调控细菌次级代谢抗菌物质合成机制方面的空白,同时该信号通路中c-di-GMP合成酶、降解酶以及受体蛋白的互作模式也能够拓宽科研工作者对c-di-GMP调控网络中信号传递的认知。