论文部分内容阅读
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一类广泛存在于环境中的持久性有机污染物，具有致畸、致癌、致突变效应，对生态环境和人体健康具有很大危害。其中苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，BaP)属于高环PAHs(HMW-PAHs)，是多环芳烃中毒性最大的一种强烈致癌物，是进行科学研究的标志性污染物。芽孢杆菌属(Bacillus sp.)是环境中一类常见的细菌，在其降解多环芳烃的功能方面有相关报道，在降解中扮演着重要角色。在细菌降解BaP的过程中，中间代谢产物变化快、累积少且分离难度大。只有少数研究分离到了BaP代谢的中间产物，但这些代谢物并不全面，目前尚无法形成完整的Bacillus代谢BaP途径链，需要深入挖掘新的代谢产物。本课题组前期分离到一株高效降解苯并[a]芘的芽孢杆菌Bacillus sp.M1，其在含苯并[a]芘(PAHs总量10μg/mL)的无机盐溶液中的降解率达54.11％，但对该菌株的优化降解条件及代谢产物、酶活性及基因表达机理尚不清晰。因此，本文以Bacillus sp.M1为研究对象，在优化其生长和降解BaP条件的基础上，结合气相色谱-质谱联用仪技术探讨M1代谢BaP产生的中间产物及酶活性，进一步利用链特异性转录组技术分析相关降解基因，揭示M1代谢BaP机理。其主要研究结果如下: (1)通过单因素和多因素试验，优化了菌株Bacillus sp.M1的生长条件以及BaP降解的条件。结果表明，M1的适宜生长条件为温度30℃，pH7.0～8.0;BaP降解率达最优(90.13％)的条件为BaP初始浓度5μg/mL、接菌量5％、温度30℃、pH7.0、含盐量1％、营养调理剂L含量1.5g/L。 (2)通过以PAHs中间代谢产物为唯一碳源的M1生长试验和M1降解BaP的代谢产物试验，研究推导了Bacillus sp.M1代谢BaP的基本途径。结果显示，在邻苯二甲酸、原儿茶酸、水杨酸、邻苯二酚、龙胆酸作为唯一碳源的条件下，Bacillus sp.M12天内对底物利用率分别达91.88％、86.02％、87.07％、65.50％、92.28％，说明了该菌株能够代谢这些小分量苯环有机物，M1可能通过水杨酸和邻苯二甲酸两种途径代谢BaP。为进一步证实其代谢途径，检测了M1降解BaP过程中的中间产物，其中4，5-二甲基菲，邻苯二甲酸酯类物质，硅烷基化的邻苯二酚、水杨酸等17种中间产物被检测到，邻苯二甲酸酯类物质累积突出。推测菌株M1的BaP降解初始位置发生在C-9和C-10位置或者C-7和C-8位置，在酶作用下生成Pyr，随后Pyr开环生成4，5-二甲基菲，在相关酶作用下生成1-羟基-2-萘甲酸，同时存在邻苯二甲酸和水杨酸两条平行的下游代谢途径，并以邻苯二甲酸代谢途径为主。 (3)通过测定BaP诱导下菌体M1酶活性试验，明确M1酶活性与其BaP降解率的关系。结果表明，邻苯二甲酸双加氧酶、水杨酸羟化酶、邻苯二酚-1，2-双加氧酶、邻苯二酚-2，3-双加氧酶、龙胆酸双加氧酶、脱氢酶6种酶的酶活性与BaP的降解率呈显著正相关，是M1代谢BaP的关键酶。说明M1代谢BaP过程中同时存在水杨酸和邻苯二甲酸途径，水杨酸再经水杨酸羟化酶被代谢为邻苯二酚和龙胆酸，邻苯二酚和龙胆酸在邻苯二酚-1，2-双加氧酶、邻苯二酚-2，3-双加氧酶、龙胆酸双加氧酶的作用下最终进入三羧酸循环阶段，生成CO2和H2O;邻苯二甲酸在邻苯二甲酸双加氧酶作用下被降解为原儿茶酸，产物最终进入三羧酸循环阶段，生成CO2和H2O。 (4)利用链特异性转录组测序，对菌株Bacillus sp.M1在BaP诱导与非诱导处理下的样本进行了转录组分析，探明了样本的显著差异基因，并进行了GO和KEGGpathway富集分析，阐明了M1代谢BaP可能的机理。结果发现，BaP诱导处理(M1P)样品表达了差异基因1354个，其中上调基因947个，下调基因407个;M1中与邻苯二酚、龙胆酸、原儿茶酸代谢相关的上调基因序列为BW16_RS10855、BW16_RS15195、BW16_RS03085、BW16_RS01690、BW16_RS04980。GO分析功能注释中功能酶基因包括作用于醛、双酚类物质、醌类物质、过氧化物、CH-CH、CH-OH的氧化还原酶、C-C、C-N、C-O裂解酶，NADH脱氢酶（醌），酰基转移酶和过氧化物酶活性;KEGG pathway分析中发现了碳水化合物代谢途径、芳香化合物代谢、杂环化合物代谢以及萘代谢路径。且在芳香化合物代谢途径和萘代谢途径中发现邻苯二酚、龙胆酸、原儿茶酸的代谢路径，佐证了M1通过水杨酸和邻苯二甲酸代谢BaP。 通过上述研究，从环境条件（温度，pH，含盐量和营养调理剂）、BaP初始浓度和接菌量方面明确了BaP高效降解的优化条件;从菌株降解PAHs的中间代谢产物、代谢酶活性、BaP诱导下的转录水平初步探明了菌株降解的机理。本研究结果对于功能微生物进行高环PAHs污染的修复提供了理论依据和技术支撑。