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胃癌是目前全世界死亡人数最多的恶性肿瘤之一,侵袭转移是影响胃癌预后的重要因素。H.pylori感染是诱导胃癌发生发展的重要危险因素,也是促进胃癌侵袭和转移的重要原因。研究发现细胞侵袭和迁移能力的增加是肿瘤侵袭和转移的关键原因,肌动蛋白骨架重排是肿瘤细胞侵袭和迁移能力增加的重要标志,因此肌动蛋白骨架的重排有可能在肿瘤的侵袭转移中起关键作用。通过文献回顾,我们发现Rho GTP酶家族的RhoA蛋白在肌动蛋白骨架重排中起重要作用,而RhoA在许多肿瘤中都高表达,且H.pylori感染能够促进RhoA蛋白活性,同时体外实验发现H.pylori感染能够诱导胃癌上皮细胞肌动蛋白骨架的变化。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是生物体中需氧细胞在代谢过程中产生的一系列氧代谢产物,有研究发现ROS能够调控RhoA活性,而H.pylori在感染时能产生大量ROS。H.pylori、肌动蛋白骨架、RhoA及ROS之间关系到底如何,并没有明确地实验说明。因此,我们假设H.pylori通过ROS/RhoA来诱导细胞肌动蛋白骨架重排来促进胃癌细胞的侵袭和转移,通过本实验进行验证。目的:1、观察H.pylori感染对MKN-45细胞形态学及肌动蛋白骨架的影响;2、研究H.pylori感染对MKN-45细胞侵袭和迁移能力的影响;3、探讨RhoA蛋白在H.pylori诱导MKN-45细胞肌动蛋白骨架变化及在侵袭和迁移中的作用;4、探讨H.pylori感染MKN-45细胞后所产生的ROS对RhoA蛋白活性的影响。方法:1、H.pylori与MKN-45细胞共培养,制作H.pylori体外感染MLN-45细胞模型,倒置相差显微镜观察MKN-45细胞被感染后形态学改变,phalloidin染色观察肌动蛋白骨架的变化;2、Transwell法检测H.pylori对MKN-45细胞侵袭力的影响,划痕实验检测H.pylori对MKN-45细胞迁移能力的影响;3、RT-PCR法检测H.pylori感染后不同时间点(0min、15min、30min、60min、180min、360min)RhoA mRNA表达量;GST及western-blot法检测RhoA蛋白活性。4、siRNA方法干扰RhoA表达,通过phalloidin染色、transwell实验检测H.pylori感染后肌动蛋白骨架及侵袭力的影响。5、流式细胞仪检测H.pylori感染后不同时间点(0min、15min、30min、60min、180min、360min)ROS的表达;NAC干预(60min)H.pylori感染的MKN-45细胞后,检测ROS下降对RhoA蛋白活性的影响。结果:1、H.pylori(MOI 100:1)与MKN-45共培养后,MKN-45细胞显著伸长并有突起伸出,分散生长,细胞间连接减少,呈现典型“蜂鸟表型”;phalloidin对F-actin染色后发现,伸长结构及突起为肌动蛋白骨架,分析细胞长径与宽径比值(L/B)后发现,H.pylori感染组比值为4.82±1.165,而PBS对照组比值为1.28±0.22;2、Transwell实验发现,100倍镜下,H.pylori感染组穿膜细胞数为1600.5±109.6,而PBS对照组为491.0±58.6,差异有统计学意义(P<0.05);划痕实验分析发现,H.pylori感染组划痕愈合面积为15.1±2.8%,而PBS对照组为4.9±2.3%,差异有统计学意义(P<0.05);3、RT-PCR检测H.pylori感染MKN-45细胞各时间点(0min、15min、30min、60min、180min、360min)RhoA mRNA表达量,发现mRNA表达量并不随时间递增,GST和western-blot实验检测RhoA蛋白活性(RhoA-GTP/total RhoA)随时间依次递增;4、应用RNAi干扰MKN-45细胞RhoA表达后,Transwell实验显示MKN-45RhoA+PBS对照组穿膜细胞为54.3±6.1个,MKN-45RhoA+H.pylori组为65.0±7.6个,两者之间无统计学差异(P>0.05);phalloidin染色显示,RhoA表达下降后,MKN-45细胞形态多为不规则形,细胞间连接少,H.pylori感染后,只有少部分细胞伸长变型,MKN-45RhoA+PBS对照组L/B结果为1.5±0.18倍,MKN-45RhoA+H.pylori组结果为1.73±0.85,两者之间无统计学差异(P>0.05);5、流式细胞仪(DCFH-DA探针)检测H.pylori感染MKN-45细胞后各时间点(0min、15min、30min、60min、180min、360min)ROS荧光强度,结果显示荧光强度随感染时间依次增强;NAC预处理MKN-45细胞1h后(特异抑制ROS),H.pylori感染MKN-45细胞6h后RhoA蛋白活性为0.57±0.05,PBS+H.pylori感染组蛋白活性为0.82±0.03,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、H.pylori感染在体外能够促进胃癌上皮细胞的伸长变型及肌动蛋白骨架的重排,且H.pylori的感染能够促进胃癌上皮细胞侵袭和迁移能力。2、RhoA蛋白在H.pylori诱导的细胞伸长变型及骨架改变中起关键作用。3、RhoA蛋白的活性与H.pylori感染诱导的ROS的相关。