论文部分内容阅读
肉毒毒素(BoNT)有A～G7个血清型，其中，BoNT／A、BoNT／B、BoNT／E三型毒素主要引起人类的肉毒中毒。BoNT在结构上分为两部分：轻链(LC，50 kD)为活性结构域，具有锌依赖性金属内肽酶活性；重链(HC，100 kD)为结合和转位结构域。其中，HC的C末端(H_C，50 kD)负责与靶细胞膜上相应受体结合，又可分为两部分：H_C1和H_C2。目前BoNT是重要的毒素战剂和高度危险的生物恐怖剂之一，因此，开展重组BoNT抗原片段的研究，对研制诊断抗体和预防疫苗具有重要意义。 为了表达重组BoNT／A LC、BoNT／BH_C2、BoNT／EH_C2，培养肉毒梭菌A、B、E将其无毒化处理作为模板，以PCR方法分别扩增出BoNT／A LC、BoNT／BH_C2、BoNT／EH_C2片段，将目的片段连接至pGEM-T载体进行测序鉴定。序列分析结果表明，3个基因片段与所报道的相应基因序列的一致性均在99％以上。然后以BamH Ⅰ+Xho Ⅰ或BamH Ⅰ+Nhe Ⅰ对pGEM-T-LC、pGEM-T-BH_C2、pGEM-T-EH_C2与原核表达载体pET21a或pET28a进行双酶切并连接，获得分别含3个基因片段的重组质粒pET21a-LC、pET28a-BH_C2和pET28a-EH_C2。经过鉴定后转化E.coliBL21(DE3)pLysS感受态细胞，用IPTG进行诱导表达后，发现BoNT／A LC、BoNT／BH_C2和BoNT／EH_C2重组蛋白都以包涵体形式存在，表达量分别达到全菌蛋白的23％、18％和37％。利用重组蛋白带有6×His标签的特性，用螯合镍离子次氨基三乙酸(Ni-NTA)的亲合层析柱对重组蛋白进行一步纯化，rBoNT／A LC和rBoNT／EH_C2的纯度在95％以上；但rBoNT／BH_C2在经过Ni-NTA柱纯化过程中发生降解，产生小片段。经Western印迹和间接ELISA分析，3种重组蛋白均可被相应的抗天然BoNT马血清或兔血清所识别，显示其具有良好的抗原性。 在所获得的3种重组蛋白中，选择rBoNT／EH_C2进行了小鼠的免疫保护评价。用纯化的重组蛋白免疫小鼠，待效价升高到一定程度后用激活的E型肉毒梭菌培养上清进行攻毒。结果显示，免疫后的小鼠可以抵抗2 MLD的BoNT／E攻击；用5 MLD的BoNT／E注射小鼠，有50％的小鼠存活；注射10 MLD和20 MLD的BoNT／E，小鼠无一存活。经统计学分析，各组小鼠的存活率差异具有显著性意义。抗rBoNT／EH_C2鼠血清的中和实验也表现了相似的结果。