[背景]恶性肿瘤严重威胁人类健康。根据不同的组织细胞来源,将之分为癌症(carcinoma)和肉瘤(sarcoma)两种,起源于上皮细胞的恶性肿瘤称为癌症,起源于间叶组织的恶性肿瘤称为肉瘤。肉瘤类型众多,世界卫生组织(WHO)对其的分类多于一百种,最常见的肉瘤类型为脂肪肉瘤和平滑肌肉瘤。大多数肉瘤类型好发于55周岁以上的成年人,如平滑肌肉瘤、恶性纤维组织肉瘤、滑膜肉瘤和脂肪肉瘤。少数肉瘤类型好发于儿童和青少年,如尤文氏肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤。相对于癌症的发病率而言,肉瘤发病率低,仅占成年人恶性肿瘤的1%,但其恶性程度高,发生血行转移早,死亡率高,几乎平均每两个肉瘤患者,就有一名发生死亡。疾病复杂性高,每一种肉瘤的生物学和分子亚型截然不同。目前临床对肉瘤的初步诊断主要通过结合病人临床表现和X线检查、CT扫描、核磁共振呈像(MRI)检查、正电子发射断层扫描(PET)等影像学手段,当怀疑为肉瘤时进行穿刺和组织活检以确诊。肉瘤的早期发现和诊断对肉瘤的预后起着决定性的作用,然而目前缺乏简单易行的早期诊断方法；活检是肉瘤诊断的金标准,但仅通过临床表现和影像学检查判断,这不可避免地造成一部分非肉瘤患者接受活检检查；而且,因为肉瘤的低发病率和有众多组织类型,即使对于经验丰富的病理学家来说,肉瘤的确诊仍具有一定的挑战性。仅采用以上三种方法的组合对肉瘤进行诊断存在一定的弊端,对于肉瘤来说,临床需要一种在疾病早期、更快速、更准确的诊断方法。血清学标志物检查是肿瘤早期诊断的有效手段之一,具有检测快速及时,采样容易方便、易于重复检测、操作简便、成本相对低廉、易于标准化等优点,有着病理学检测不可替代的地位。目前,临床常用的肿瘤血清标志物主要有前列腺特异性抗原PSA、癌胚抗原CEA、甲胎蛋白AFP、细胞角蛋白19片段CYFRA21-1、鳞状细胞癌相关抗原SCC、神经特异性烯醇化酶NSE、糖类抗原CA19-9、糖类抗原CA125等。同时,新的肿瘤标志物也在随着研究不断推出。目前在肉瘤患者的实验室检查中,部分患者的血常规结果可出现贫血和/或中性粒细胞增多,血沉增快,尤文氏肉瘤和骨肉瘤患者可出现血清乳酸脱氢酶增高、碱性磷酸酶增高,软骨肉瘤患者可有糖耐量异常等,但是这些指标均缺乏特异性,所以特异的血清学指标对肉瘤的诊断尤为重要。越来越多的研究资料表明,Endosialin/TEM1 (CD248)分子有望成为肉瘤新的血清学标志物。CD248是一种单次跨膜糖蛋白,蛋白质部分分子量80.9KDa,含有757个氨基酸。包括细胞外部分、细胞内部分和跨膜部分,其中细胞外部分包含1个Sushi结构域、1个C型凝集素样结构域、3个表皮生长因子(EGF)样结构域和1个mucin样区；其细胞外结构复杂,而细胞内结构域却非常短,只有51个氨基酸,包含有3个潜在的磷酸化位点和一个C末端PDZ结合端,细胞内、外部分通过一段跨膜蛋白相连。CD248在胚胎发育中高表达,伴随个体出生表达量逐渐降低,在健康成年个体中除肾脏、子宫内膜外基本不发生表达。CD248分子在1992首先被确定为一种肿瘤内皮抗原,后续的研究认为CD248主要表达在肿瘤的基质纤维细胞和周细胞上,与肿瘤的预后和进展相关。国内外研究人员使用抗CD248抗体对临床标本进行免疫组织化学染色、流式细胞检测,以及基因表达序列分析(SAGE)、Northern Blot等方法证明CD248在肉瘤组织中发生高表达,滑膜肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、脂肪肉瘤、骨肉瘤等肉瘤细胞上都能检测到CD248的表达,且当肉瘤细胞在体外培养时,培养上清中也可以检测到CD248分子。CD248分子在慢性肾脏性疾病患者体内发生过量表达,参与肾脏纤维化过程,与肾脏纤维化程度相关。除此之外,CD248也在多种癌症、关节炎患者体内发生过量表达。综上所述,我们拟在本研究中制备抗CD248多克隆抗体,并建立CD248分子的双抗体夹心ELISA检测方法,为后续临床肉瘤、各种癌症、慢性肾脏病、关节炎等相关疾病患者血清中CD248分子的检测奠定实验基础。[目的]1.采用原核表达的方式获得CD248蛋白；2.获得CD248兔源性、鼠源性多克隆抗体；3.建立Endosialin/TEM1 (CD248)的双抗体夹心ELISA检测方法。4.对建立的Endosialin/TEM1(CD248)的双抗体夹心ELISA检测方法进行初步评价。[方法]1.构建原核表达载体,诱导表达后经纯化获得目的CD248蛋白依照赵爱志博士赠送的pGEX-2TK/CD248载体中人CD248基因序列及表达载体pMAL-5x多克隆位点序列,设计相应引物,PCR扩增CD248片段。经T载体连接后,双酶切构建到pMAL-5x原核表达载体。将测序验证的pMAL-5x-CD248表达载体转入表达宿主菌BL21, IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳确定目的蛋白条带位置是否符合预期。鉴定目的蛋白表达形式。对以包涵体表达为主的pMAL-5x-CD248诱导表达后,进行包涵体的洗涤、溶解和复性。获得目的蛋白。2.目的蛋白免疫动物制备兔源性、鼠源性多克隆抗体将9只BALB/c小鼠分3组以CD248蛋白为抗原,采用32.05μg、64.1μg、128.2μg三种不同免疫剂量对小鼠进行免疫。每7天免疫一次。第四次免疫后7天进行效价检测,三组小鼠第五次免疫分别采用64.1μg MBP-CD248,64.1μg GST-CD248和5x105个表达CD248的活性良好的骨肉瘤SJSA-1细胞进行加强免疫,第五次免疫后10天摘眼球取血并分离血清。新西兰大白兔前三次免疫均使用897.4μg MBP-CD248蛋白,加强免疫分别采用897.4ggMBP-CD248蛋白和1.7x106个活性良好的人骨肉瘤SJSA-1细胞。第四次免疫后7天,颈动脉取血分离血清。用3μg/ml纯化后MBP-CD248蛋白包被板条,采用间接ELISA方法分别检测BALB/c小鼠和新西兰大白兔CD248抗血清效价。3.建立Endosialin/TEM1 (CD248)的双抗体夹心ELISA检测方法以不同浓度的纯化后兔1血清包被ELISA酶标板作为捕获抗体,不同浓度的6号小鼠抗血清为检测抗体,不同稀释度HRP标记的羊抗鼠抗体为酶标二抗。以纯化的CD248蛋白为靶抗原,用棋盘滴定法确定最佳的反应条件。建立双抗体夹心ELISA检测方法。4.对建立的Endosialin/TEM1 (CD248)的双抗体夹心ELISA检测方法进行初步评价对MBP-CD248蛋白和GST-CD248蛋白进行倍比稀释,确定新建立ELISA方法的检测灵敏度。对人SJSA-1骨肉瘤细胞传代后108h时培养上清中的CD248分子进行检测,对健康对照人群和慢性肾脏病患者的血清进行检测,初步评价建立的Endosialin/TEM1 (CD248)的双抗体夹心ELISA检测方法。[结果]1.采用基因工程方法,成功构建原核表达载体pMAL-5x-CD248,经双酶切鉴定、PCR鉴定和测序鉴定目的片段均正确,未发生阅读框移码等改变。IPTG诱导后目的蛋白大小在75KDa左右,符合预期目的蛋白大小。确定MBP-CD248蛋白和GST-CD248最佳诱导表达条件均为1mM IPTG,30℃诱导5h。GST-CD248蛋白以可溶性表达形式为主,使用柱亲和层析方法进行纯化；MBP-CD248蛋白以包涵体表达形式为主,经包涵体洗涤方法进行纯化,纯化后,经复性获得目的蛋白,浓度分别为300μg/ml和1282μg/ml。2.主要使用三种不同剂量的纯化后MBP-CD248蛋白对小鼠进行免疫,低剂量组三只小鼠的抗血清效价分别为：1：102400；1：204800、1：409600；中剂量组三只小鼠的抗血清效价分别为；1：204800、1：204800、1：102400；高剂量组三只小鼠的抗血清效价分别为1：204800、1：204800、1：204800。所有小鼠抗血清效价均达到十万,达到实验要求,且未出现免疫耐受现象,证明对Balb/c小鼠皮下注射CD248蛋白60-129μg/只,联合使用弗氏完全/不完全佐剂,可以达到较好的免疫效果。高剂量组小鼠抗血清效价均为1：204800,免疫效果更稳定。两只兔抗血清免疫效价均达到百万。3.主要采用棋盘滴定方法对建立的双抗体夹心ELISA检测方法进行优化,其中捕获抗体为纯化的CD248兔多抗,稀释度为1：500,稀释后浓度为15.12μg/ml,检测抗体为CD248鼠多抗,稀释度为1：16000,二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体,浓度为1：20000,达到最佳反应条件。4.双抗体夹心ELISA检测方法可检测MBP-CD248蛋白的最低浓度为18.31ng/ml,可检测GST-CD248的最低浓度为585.94ng/ml。在SJSA-1细胞培养后108h可以检测到培养上清中的CD248分子。可以将部分慢性肾脏病患者从健康对照人群众区分出来。[结论]1.成功构建CD248原核表达载体,诱导后表达纯化获得目的蛋白；2.成功制备兔源性、鼠源性多克隆抗体；3.初步建立Endosialin/TEM1 (CD248)的双抗体夹心ELISA检测方法并对其进行初步评价。