双乙酰具有奶油风味,是乳制品中的重要风味化合物,虽然也可经化学方法生产,但在乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)这个“细胞工厂”中天然产生更佳。将国内优良野生菌资源开发成天然的高产双乙酰细胞工厂,是有必要和有意义的。已有一些针对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, L.lactis)高产双乙酰的研究,但大多为通过转基因或充分提供有利条件的方式,所以有必要研究非转基因的高产双乙酰GRAS菌。此外,目前对粪肠球菌(Enterococcus faecalis, E.faecalis)的高产双乙酰研究很少,因此将其与L.lactis进行对比研究来探索其产双乙酰性能,同时进一步深化研究L.lactis,这很有意义。此外,在生物信息学时代,测定优良菌株的全基因组对深入揭示高产双乙酰机制很有助益。本课题包括8组试验,可以概括为4大部分,分别为出发菌株选择、高产双乙酰的前提、原因和最佳菌基因组测定。具体为先确定野生株、商用株、参考株、诱变株等出发菌株(另一种分类为L.lactis、E.faecalis)；然后研究丙酮酸的积累,即柠檬酸和氨基酸向丙酮酸的转化；继而研究酶活(内因)与pH等(外因)对双乙酰代谢的影响；最后对最佳菌KLDS4.0325进行基因组层面的分析。先从KLDS保存的86株野生乳球菌和30株野生肠球菌(均经16S rDNA鉴定),筛选产量大于0.08g·L-1的13株野生出发菌株(9株L.lactis和4株E.faecalis),另外选择从KHS商用发酵剂中分离出的1株商用株、限制性诱导自NZ9000的参考株、NTG诱变的突变株,最终共筛选出16株出发菌(11株L.lactis和5株E.faecalis),对其进行产双乙酰初步检测。另外,检测7种市售乳制品的双乙酰含量。在此基础上,通过柠檬酸利用选择性培养基和质粒提取、CIT特异性引物PCR的方法,选择KLDS4.0325、KLDS4.100、KLDS4.1002(L.lactis)和KLDS4.1003、KLDS4.0326、 KLDS4.1004(E.faecalis)共6株代表菌,测定100min的柠檬酸消耗与双乙酰、乙偶姻生成,发现L.lactis的柠檬酸利用水平均强于E.faecalis的,后者中最强的KLDS4.1003较接近前者中最弱的KLDS4.1002。还研究了柠檬酸消耗的影响因素以及柠檬酸-葡萄糖的共代谢。此外,对KLDS4.0325和KLDS4.1004分别测质粒基因组和进行限制性物理图谱绘制。研究了氨基酸对丙酮酸积累的影响,选取10种氨基酸,测量其对16株出发菌的作用,发现Asp和Ala作用最明显,但对5株E.faecalis均无效。对柠檬酸利用最强的KLDS4.0325、 KLDS4.1001和KLDS4.1002在pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0测量丙酮酸积累及双乙酰生成,3株菌的丙酮酸积累均为8.0时最大、4.5时最小。与柠檬酸积累共同考虑的情况下，pH6.5、7.0、7.5时对协同积累丙酮酸最为有利。丙酮酸过量后研究的关键在于ALD酶,故对KLDS4.1004和KLDS4.1005进行NTG诱变获得诱变株KLDS4.1003,两者柠檬酸吸收效率相当,在5h后诱变株的利用效率还高于亲本株,最终在10h时将柠檬酸共同耗尽,说明诱变不会抑制CIT和ALS酶活,两株仅在ALD活性上有差别；另外,KLDS4.1003的生长速度大于亲本株(仅在3、4、8h三个点约相同),这证明NTG诱变非但未影响诱变株的生长,还对其有利。选择pH这一条件因素来继续研究。在pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0条件下分别对代表L. lactis的野生株KLDS4.0325和商用株KLDS4.1001,与代表E.faecalis的野生株KLDS4.1004和诱变株KLDS4.1003进行对比酶活分析,发现L. lactis的LDH、DR、 ALD酶活均比E.faecalis的低,这也解释了为何前者的产双乙酰能力较强。发现L.lactis的最大生长速度和细胞计数普遍分别比E.faecalis慢、大,而双乙酰产量却较高,推断酶活和细胞数的综合因素要大于生长速度。总体来说,6.5、7.0对两类菌均为研究重点,7.0时是因为此时酶活合适、6.5时是因为菌数较多。选择两种菌各1株代表,即KLDS4.0325和KLDS4.1003在pH6.5、7.0,分别于4、8、12、16、20、24h共6个时间点检测菌数及双乙酰产量变化,发现在有限的底物空间与营养条件下,菌数过多会导致产双双乙酰能力降低。最后,为将KLDS4.0325开发成高产香发酵剂,对其进行进一步研究,测定了全基因组数据,并将其与L.lactis的代表菌株进行对比。课题全篇包括两个对比,一是野生菌、商用菌、诱变菌、工程菌的对比；二是L.lactis与E.faecalis的对比。本课题的创新点是：(1)按照产双乙酰代谢顺序,比较分析不同米源的乳酸乳球菌和粪肠球菌在相关条件下产双乙酰量的差异,发现所试乳酸乳酸菌的双乙酰含量高于粪肠球菌。并最终获得产双乙酰能力很强的KLDS4.0325和KLDS4.1003,作为中国特色天然野生菌细胞工厂；(2)分析了乳酸乳球菌、粪肠球菌利用柠檬酸和氨基酸产生双乙酰代谢途径中丙酮酸的重要作用。分别以柠檬酸、氨基酸为底物测定和优化了菌株产生双乙酰的条件,并将E.faecalis KLDS4.1004和L.lactis KLDS4.0325代谢柠檬酸的基因定位在质粒上,并对CIT+质粒分别进行限制性图谱绘制与质粒基因组测定；(3)从天然角度(而非转基因等分子手段),研究细菌生长情况、酶活以及pH的影响,全面分析出发菌高产双乙酰的内因与外因；(4)对高产双乙酰菌株KLDS4.0325全基因组进行了测序分析,为双乙酰的代谢网络控制分析奠定了基础。