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脓毒症是由感染因素介导的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),是严重创伤、烧伤及大手术后病人的常见并发症,进一步发展可导致休克和多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfuction syndrome,MODS),严重威胁患者生命。细菌内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌外膜结构中的主要成分,研究表明,LPS是引起脓毒症的主要病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。LPS与其模式识别受体Toll样受体4 (Toll like receptor 4, TLR4)结合形成复合物后,引发单核/巨噬细胞等的活化,诱导脓毒症的发生。既往研究认为,LPS主要通过启动跨膜信号转导的方式发挥活化细胞的效应,而LPS的内化与其降解代谢过程有关。近期研究发现,LPS可以通过内化的方式与TLR4共同进入内体,进而发挥其对单核/巨噬细胞的活化作用。然而目前有关内化调控LPS诱导信号转导通路的具体作用及其机制尚不明确,因此本研究旨在探讨LPS-TLR4复合物的内化途径及其对LPS活化巨噬细胞的作用及可能机制。目的建立LPS-TLR4复合物内化障碍的巨噬细胞模型,研究内化障碍对LPS活化巨噬细胞的影响及其可能的机制。方法1.内化障碍的模型RAW264.7细胞的建立(1)应用化学抑制剂构建内化障碍模型RAW264.7细胞①网格蛋白抑制剂MDC利用MDC特异性的抑制巨噬细胞内化过程中网格蛋白的功能,建立LPS-TLR4复合物内化障碍的模型RAW264.7细胞。②缢断蛋白抑制剂dynasore利用dynasore特异性的抑制巨噬细胞内化过程中缢断蛋白的功能,建立LPS-TLR4复合物内化障碍的模型RAW264.7细胞。③内体酸化成熟抑制剂氯喹利用氯喹抑制巨噬细胞内体的成熟,建立内化障碍的模型RAW264.7细胞。(2)siRNA技术干预网格蛋白应用siRNA技术干预巨噬细胞内化过程中网格蛋白的功能,建立内化障碍的模型RAW264.7细胞,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察LPS-TLR4复合物的内化情况。2. LPS对内化障碍模型RAW264.7细胞的刺激作用研究(1)应用LPS(100ng/ml)刺激内化障碍的RAW264.7细胞,在LPS处理2h后,提取细胞总RNA,用RT-PCR方法检测IL-6和TNF-α在核酸水平的表达情况;在LPS处理24h后,用ELISA方法检测细胞上清中IL-6和TNF-α在蛋白水平的表达情况;并同时应用小鼠炎症细胞因子抗体芯片技术检测细胞上清中炎症介质总体的分泌情况。3. LPS-TLR4复合物的内化对LPS诱导巨噬细胞活化的调控机制研究(1)应用RT-PCR方法检测内化障碍的模型RAW264.7细胞在LPS刺激后2h的MyD88 mRNA和TRAM mRNA的表达情况。(2)对内化障碍的模型RAW264.7细胞,在LPS(100ng/ml)刺激4h和12h后,提取细胞核蛋白,用ELISA法检测NF-κB的变化情况。(3)对内化障碍的模型RAW264.7细胞,在LPS(100ng/ml)刺激12h后,提取细胞浆蛋白,用western blot检测JNK,ERK, p38和IκBα磷酸化水平以及IRF3的降解变化情况。结果1.内化障碍的模型RAW264.7细胞的建立(1)应用化学抑制剂MDC,dynasore和氯喹,在流式细胞仪和激光共聚焦显微镜下,均观察到RAW264.7细胞中LPS-TLR4复合物的内化被显著抑制。成功建立了内化障碍的模型RAW264.7细胞。(2)应用siRNA技术干扰网格蛋白功能,本研究未能获得稳定转染的RAW264.7细胞株。2. LPS对内化障碍模型RAW264.7细胞的刺激作用研究(1)在用MDC和dynasore构建的模型RAW264.7细胞中,观察到在LPS刺激后细胞对IL-6的表达在核酸和蛋白水平均被显著抑制,而对TNF-α的表达在核酸和蛋白水平均无明显影响。(2)在用氯喹构建的模型RAW264.7细胞中,观察到在LPS刺激后TNF-α和IL-6的表达在核酸和蛋白水平均被显著抑制。(3)细胞因子抗体芯片检测结果显示:在MDC和dynasore构建的模型RAW264.7细胞中, LPS刺激后多种促炎/抗炎细胞因子和趋化因子分泌降低,而促炎因子IL-12p40p70的分泌显著增高;在氯喹构建的模型RAW264.7细胞中,LPS刺激后炎症介质总体的分泌水平是下降的。3. LPS-TLR4复合物的内化对LPS诱导巨噬细胞活化的调控机制研究(1)在MDC和dynasore构建的模型RAW264.7细胞中,应用半定量RT-PCR技术观察到,在LPS刺激后细胞TRAM mRNA的表达被显著抑制,而MyD88 mRNA的表达无明显抑制;但在氯喹构建的模型细胞中,观察到MyD88和TRAM mRNA的表达均被显著抑制。(2)在MDC和dynasore构建的模型RAW264.7细胞中,在LPS刺激后,观察到细胞中NF-κB的晚期活化受到显著抑制;而在氯喹构建的模型细胞中,观察到NF-κB的早期、晚期活化均受到显著抑制。(3)在MDC、dynasore以及氯喹构建的内化障碍RAW264.7细胞中,在LPS刺激后,应用Western blot检测发现,细胞中JNK,ERK, p38和IκBα的磷酸化水平以及IRF3的降解均受到显著抑制。结论(1)在LPS通过TLR4诱导巨噬细胞活化的两条通路中,MyD88非依赖的信号转导途径与LPS-TLR4复合物的早期内化密切相关;而氯喹对内化过程中内体的酸化成熟抑制,对TLR4介导巨噬细胞活化的MyD88依赖和非依赖两条信号转导途径均具有抑制作用。(2)在网格蛋白和缢断蛋白功能障碍的巨噬细胞中,LPS-TLR4复合物的早期内化障碍对MyD88非依赖的信号转导途径的抑制作用,可能是通过下调TRAM mRNA的表达,影响其下游信号转导分子如晚期NF-κB ,MAPKs及IRF3等分子的活化而实现对巨噬细胞活化的影响;而氯喹对TLR4介导的MyD88依赖和非依赖两条信号转导途径均具有抑制作用,其机制可能与氯喹抑制巨噬细胞的内体酸化成熟,导致LPS-TLR4复合物在内体中屯积,阻断了TLR4的胞内→外膜循环,导致TLR4的回膜障碍有关。