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目的利用高通量测序技术和qRT-PCR扩增方法分析药物难治性癫痫患儿外周血microRNAs(miRNAs)表达谱,并筛选出特异性差异表达的miRNAs,以期为早期识别药物难治性癫痫找到有潜在诊断价值的生物标志物;运用生物信息学技术预测差异表达miRNAs的靶基因,并分析候选靶基因的类别、分子功能以及参与的通路,从而分析miRNAs参与儿童癫痫耐药的可能机制,为探索药物难治性癫痫新的有效治疗靶点提供线索。方法1.选择2018年1月-2019年6月就诊于郑州大学第一附属医院儿童神经专科门诊,已明确癫痫诊断并接受抗癫痫药物治疗至少1年的患儿,根据2010年国际抗癫痫联盟制定的药物难治性癫痫的定义及癫痫症状控制情况,将患儿分为药物难治性癫痫组(R组)、药物反应性癫痫组(F组)。同期在本院体检的儿童为健康对照组(J组)。2.采集病例组和对照组儿童的晨起空腹外周全血2.5ml,提取每个样本的总RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增后,应用Illumina NovaSeq6000平台进行高通量测序,并分析药物反应性癫痫和药物难治性癫痫患儿全血标本中miRNAs表达谱。3.应用DESeq软件对各组miRNAs的表达水平进行差异显著性分析,筛选出候选miRNAs,运用qRT-PCR扩增方法验证候选miRNAs在全血标本中的表达水平,进一步获得目标miRNAs。4.应用 miRWalk、TargetScan、miRDB、miRTarBase 等在线数据库预测和筛选目标miRNAs的靶基因。应用DAVID在线数据库对候选靶基因进行GO分类功能注释分析和KEGG通路富集分析。结果1.高通量测序时,3组各纳入5例;PCR扩增时药物难治性癫痫组、药物反应性癫痫组、对照组分别纳入5例、7例、6例。在两个研究阶段,癫痫儿童和健康儿童在年龄、性别方面均无统计学差异。2.药物难治性性癫痫外周全血中miRNAs表达差异分析:与对照组比较,药物难治性性癫痫共有95个差异表达miRNAs,其中70个miRNAs表达上调,25个miRNAs表达下调。与药物反应性癫痫组比较,药物难治性性癫痫共有68个差异表达miRNAs,其中22个miRNAs表达上调,46个miRNAs表达下调。3.药物反应性癫痫外周全血中miRNAs表达差异分析:与对照组比较,药物反应性癫痫组共有82个差异表达miRNAs,其中71个miRNAs表达上调,11个miRNAs表达下调。4.qRT-PCR扩增验证:对11个候选miRNAs,表达下调:let-7a、let-7f、miR-15a-5P、miR-1299,表达上调:miR-19b-5P、miR-99a-5P、miR-99b-5P、miR-125a-5P、miR-125b-5P、miR-142-5P、miR-100,进行 qRT-PCR 扩增验证,结果发现,let-7f、miR-99a-5p、miR-99b-5p、miR-125b-5p、miR-142-5p、miR-100、miR-125a-5p表达水平变化趋势和高通量测序分析结果一致。5.ROC 曲线分析:当 miR-99a-5p、miR-99b-5p、miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR-142-5p、miR-100 的 cutoff 值分别大于 0.56、0.62、5.53、2.24、2.09、0.59,这些miRNAs均以较高的AUC(≥0.871)、敏感度(≥80%)及特异度(≥85.7%),有望成为诊断药物难治性癫痫的生物标记物;其中miR-99a-5p(AUC为0.971)、miR-125b-5p(AUC为0.971)诊断药物难治性癫痫最优。6.候选靶基因的预测、KEGG和GO分析:7个目标miRNAs的候选靶基因数分别为532、73、45、590、681、67、93个,对4个在线数据库预测的靶基因取交集,所得靶基因数分别为81、8、3、58、81、4、2个。对候选靶基因进行KEGG和GO分析,KEGG分析显示候选靶基因可能参与的通路包括:AMPK信号通路、FoxO信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、鞘磷脂信号通路、p53信号通路、神经营养蛋白信号通路、mTOR信号通路、Jak-STAT信号通路、P13K-Akt信号通路、神经胶质瘤、TGF-β信号通路;GO分析显示:候选靶基因在生物学过程中主要富集于胚胎后的发育、转录调控、蛋白质自身磷酸化,在细胞组分中主要富集于核原生质、胞液、膜、细胞质、细胞核,在分子功能中主要富集于蛋白结合、mRNA 3’-UTR结合、RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性DNA结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白激酶活性。结论1.本研究发现癫痫患儿外周全血中miRNAs与健康儿童相比有明显差异,在药物反应癫痫组及药物难治性癫痫组患儿之间外周全血中miRNAs表达也存在明显差异,推测癫痫发作及癫痫患儿对治疗的反应可能影响患儿外周全血中miRNAs的表达。2.本研究在药物难治性癫痫组中筛选出6个差异表达的miRNAs:miR-99a-5p、miR-99b-5p、miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR-142-5p、miR-100,其中miR-99a-5p、miR-125b-5p可能有望成为诊断药物难治性癫痫的潜在生物标记物之一。3.本研究推测miR-99a-5p和miR-125b-5p可能是药物难治性癫痫的治疗靶点之一,miR-125b-5p的候选靶基因参与调控的5个通路:HIF-1信号通路、MAPK信号通路、鞘磷脂信号通路、神经营养蛋白信号通路、mTOR信号通路,可能和药物难治性癫痫的耐药机制相关。