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干扰素刺激基因15(ISG15)是一种类泛素蛋白,可在干扰素刺激下由isg15基因编码产生。其在序列、结构和功能上均与泛素类似,能够通过酶级联反应共价修饰靶蛋白。ISG15及其类泛素修饰系统参与免疫应答,是干扰素发挥抗病毒效应的重要途径。本研究利用重组猪IFN-α作为标准刺激物,验证了检测ISG15及ISG化方法的可行性,包括采用实时定量逆转录PCR(RQ-RT-PCR)检测ISG15转录水平;采用间接免疫荧光(IFA)、流式细胞术(FCM)和免疫印迹(WB)三种技术检测ISG15翻译水平;采用WB检测ISG15修饰水平。实验结果表明这些方法均能有效地检测ISG15及ISG化。通过上述方法的联合应用,本研究证实了猪瘟病毒感染可引起ISG15转录、翻译和修饰水平发生显著上调。以1moi猪瘟病毒感染PK-15细胞为例,使用RQ-RT-PCR可在病毒感染9、12、24和48 h后发现ISG15 mRNA分别上调15.89、65.80、121.94和128.89倍;使用IFA可在病毒感染9 h后观察到ISG15显著上调;使用FCM可在病毒感染6、12、24 h后发现ISG15阳性细胞率由0 h的0.27%分别提升至3.37%、6.81%和19.42%;使用WB可在病毒感染12 h后检测到ISG15特异性蛋白条带及ISG化类泛素修饰现象,并且发现其含量与猪瘟病毒蛋白E2呈明显相关性。实验结果表明ISG15及其类泛素修饰系统可在猪瘟病毒感染过程中发挥重要作用。本研究通过对比普通PK-15细胞和过表达ISG15的PK-15细胞发现,以1 moi猪瘟病毒为例,过表达ISG15可造成猪瘟病毒5’-UTR含量在病毒感染 9、12、24 和 48 h 后分别下降约 34.47%、58.25%、63.40%和 49.30%;病毒蛋白E2含量明显减少;病毒滴度在病毒感染9、12、24和48 h后分别下降约58.33%、62.50%、46.67%和58.33%。实验结果表明过表达ISG15不仅能够显著减少猪瘟病毒RNA丰度和病毒蛋白含量,而且可以降低病毒滴度,说明ISG15具有抑制猪瘟病毒复制的生物活性。本研究使用经紫外线灭活的猪瘟病毒接种细胞后,发现ISG15及其类泛素修饰水平并不会发生显著变化,说明猪瘟病毒的活性对于激活ISG15表达和修饰是必需的。为了阐明猪瘟病毒上调ISG15的途径,本研究利用WB检测了 IRF3、NF-κB,以及HDAC6抑制剂对于ISG15表达的影响,但实验结果表明在猪瘟病毒调控ISG15的过程中IRF3和NF-κB的表达不会受到影响,并且猪瘟病毒不经由HDAC6调控ISG15。