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腓骨肌萎缩症2A型（CMT2A）是一种由于Mfn2基因突变引起的,遗传模式为常染色体单基因显性遗传的运动感觉神经性疾病。Mfn2编码的线粒体融合蛋白2（Mfn2）是一种高度保守的GTP酶,在调节线粒体外膜融合和细胞代谢中起着核心作用。早期研究认为线粒体融合与裂变之间的平衡对于线粒体的形态和功能至关重要,线粒体融合受损会导致CMT2A。有研究认为Mfn2突变介导的线粒体过度融合也是驱动CMT2A病理的原因。Mfn2不同等位基因的突变导致CMT2A疾病的原因比较复杂,因此,基于不同的致病位点构建Mfn2突变的CMT2A疾病模型对于复杂机制的解析是非常必要的。近年来,CRISPR/Cas9单碱基编辑系统已被广泛应用于构建人类遗传疾病动物模型,因为它可以通过腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）或胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）系统特异性地实现A·T到G·C或C·G到T·A碱基的转换,且不会造成DNA双链断裂（DSB）和DNA核酸链断裂引起的同源重组（HDR）。同时,CMT2A疾病是由单核苷酸突变造成的,因此CRISPR/Cas9单碱基编辑系统是用于构建CMT2A疾病模型的主流工具。此外,小鼠和人的Mfn2基因编码的氨基酸序列的相似度不低于95%,故小鼠是模拟人CMT2A疾病模型合适的模式动物。为了进一步理解CMT2A的发病机制,本研究通过模拟人Mfn2基因的已知致病位点构建小鼠疾病模型,为Mfn2突变导致该疾病的发生机制研究提供良好的基因编辑动物模型。同时结合体内体外研究CMT2A的发病机理,也为该疾病的治疗提供理论研究基础。主要研究内容如下:（1）利用ABEmax-NG或Anc BE4max-NG碱基编辑器将目的突变引入到C2C12成肌细胞中,包括杂合(Mfn2R364W/+、Mfn2G176S/+、Mfn2H165R/+)及纯合(Mfn2R364W/R364W、Mfn2G176S/G176S、Mfn2H165R/H165R)突变。然后,对Mfn2G176S、Mfn2H165R（位于GTP酶结构域）和Mfn2R364W（位于螺旋束1结构域）突变的细胞模型表型进行了表征。结果表明,在Mfn2H165R/H165R突变细胞中存在明显的线粒体聚集及Mfn2的局灶性分布,而Mfn2R364W、Mfn2G176S和Mfn2H165R/+突变细胞中则未表现出此特征。三种杂合及纯合突变体中均呈现显著性的线粒体丢失以及明显的线粒体断裂。（2）针对线粒体断裂的原因进行解析,结果显示Mfn2突变并没有简单地导致参与OMM融合的Mfn2的缺失,而是诱导参与IMM融合的视神经萎缩蛋白1（Opa1）的水解切割。通过对细胞凋亡及线粒体氧化磷酸化损伤的过程进行深入研究,我们发现在保留Mfn2表达的Mfn2R364W、Mfn2G176S和Mfn2H165R/+中,该水解过程与Bax诱导的细胞凋亡以及由于线粒体质量控制效率降低而导致呼吸和ATP产生解偶联有关。在Mfn2缺失的Mfn2H165R/H165R中,该水解过程与Mfn2损失诱导线粒体膜电位（MMP）耗散进而触发细胞凋亡和氧化磷酸化过程的解偶联有关。（3）最后,利用ABEmax-NG或Anc BE4max-NG碱基编辑系统以及胚胎移植技术构建了Mfn2H165R/H165R、Mfn2G176S/+和Mfn2R364W/+突变模型小鼠,并通过行为学分析、组织病理学分析以及轴突神经损伤研究描述了神经病的表型和病理生理症状。Mfn2H165R/H165R小鼠表现出明显的高弓足形态且行动迟缓,体型瘦小并在1.5月龄死亡。Mfn2R364W/+和Mfn2G176S/+小鼠均显示运动功能障碍和神经肌肉损伤。Mfn2G176S/G176S小鼠在2月龄出现明显的足趾肿胀和弯曲,并发生死亡。在此基础上,通过在体内水平探究细胞凋亡和线粒体氧化磷酸化损伤的分子发生机制,再次验证了CMT2A的发病机理,即保留Mfn2表达水平的基因型中Opa1的水解切割与募集Bax引起的凋亡和氧化磷酸化解偶联有关。整体融合活性的丧失影响线粒体DNA（mt DNA）稳定性、造成线粒体功能障碍,最终导致CMT2A的发生。本研究解析了Mfn2突变造成线粒体融合损伤的分子发生机制,同时推断由Mfn2R364W、Mfn2G176S、Mfn2H165R/+和Mfn2H165R/H165R突变引起的CMT2A发病机制的差异,包括线粒体的分布、线粒体外膜相关蛋白的表达以及线粒体复合物I的酶活性,可能与Mfn2的表达有关。线粒体融合损伤机制的解析为CMT2A疾病的治疗提供新思路,针对不同位点的临床前诊断研究是必不可少的。