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“健康养殖”模式已成为实现我国奶牛养殖业蓬勃发展的根本保障和必然趋势,为规范奶牛集约化养殖、改善奶牛健康以及减少抗生素滥用指明了方向。奶牛乳腺炎作为危害奶牛健康的感染性疾病,因其频发与治疗效果的不佳,依旧是阻碍奶牛养殖业健康养殖模式稳步前进的重要因素。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起奶牛乳腺炎的主要的病原菌之一,既可以通过调节自身代谢过程来抵抗环境应激,也可以通过进入宿主细胞来逃避免疫杀伤,从而在疾病感染过程中极难被根除。抗生素的使用虽提高了奶牛乳腺炎的治疗效果,但也诱发了细菌对抗生素的多种抵抗策略,抗生素耐受性便是其中之一。除此之外,研究表明抗生素耐受性不仅作为耐药性进化的基础还是临床慢性疾病感染与复发的关键所在。阳离子/质子反转运体（Cation/Proton Antiporters,CPA）是细菌体内进化出的一套以Na+/H+交换为主的转运系统,能使细菌在面对极端环境时维持胞内p H以及渗透压的稳定。研究表明CPA可以影响细菌的生长代谢状态,但是对于CPA是否能够导致细菌产生抗生素耐受性这一问题未见报导。本试验前期选择金黄色葡萄球菌Newman作为研究对象,通过抗生素体外诱导获得具有耐受表型的诱导菌株,通过全基因组测序以及蛋白组学测序筛选出关键基因NWMN＿0545和cpa1-1。结合前期试验结果,利用分子生物学手段,探究CPA如何介导金黄色葡萄球菌对抗生素产生耐受表型的分子机制。研究结果如下:（1）NWMN＿0545突变导致抗生素多重耐受表型的产生。通过4种抗生素（Cefepime、Dicloxacillin、Flucloxacillin、Nafcillin）体外诱导出具有耐受表型的菌株:Dic-T5-20、Nafc-T5-17、Fluc-T5-20和Cefe-T5-17。通过全基因组测序筛选到四株耐受菌株具有一致的NWMN＿0545基因突变。通过构建回补菌株(0545mut-p SC1-P0545)、敲除菌株（Newman-Δ0545）以及杀菌曲线检测确定NWMN＿0545的突变导致了耐受表型的出现。通过生长曲线检测以及交叉耐受表型检测确定0545mut菌株不仅具有迟缓期延长表型（P<0.01）;也具有青霉素类、头孢类、碳青霉烯类、糖肽类以及喹诺酮类抗生素的多重耐受表型（P<0.01）。（2）0545mut菌株中cpa1-1的下调导致抗生素耐受表型的产生。因NWMN＿0545无相关文献报导其功能,于是将0545mut菌株送至蛋白质组学测序。根据测序结果发现Na+/H+反转运基因cpa1-1表达量显著下调（P<0.01）,并通过q PCR验证了cpa1-1表达量变化;通过0545mut菌株胞外p H检测证明Na+/H+反转运调节功能降低;通过构建过表达菌株(0545mut-p SE1-cpa1-1)、敲除菌株（Newman-Δcpa1-1）以及杀菌曲线检测证明0545mut菌株中cpa1-1的下调导致迟缓期延长表型以及耐受表型的产生。（3）Na+/H+反转运功能降低导致金黄色葡萄球菌产生抗生素耐受表型。通过不同p H、高Na+/K+浓度条件下Newman野生型的杀菌曲线测定,表明在强酸性（p H=4.5）状态下Newman出现耐受表型以及迟缓期延长表型（P<0.01）;在高Na+/K+浓度（1M Na Cl/KCl）状态下也出现耐受表型,但对迟缓期的影响不如p H显著。本试验通过检测人为制造Na+/H+反转运功能抑制状态下Newman对抗生素的表型证明Na+/H+反转运功能受到抑制可以介导金黄色葡萄球菌产生对抗生素的耐受表型。（4）cpa1-1与NWMN＿0545关联的初探:通过IP试验钓出与NWMN＿0545结合的Mgr A、Sar A、Sar Z、Pur R等蛋白;通过DNA Pull-down试验钓出与Cpa1-1启动子结合的Sar A、Sar R、Rzc A、Agr A等调控蛋白;通过质谱分析筛选出关联的候选调控基因:mgr A、sar A、sar R、sar X、sar Z、rzc A、pur R、agr A。本试验尝试探索cpa1-1与NWMN＿0545之间由什么基因进行调控,从而导致Na+/H+反转运功能的降低。综上所述,本试验成功诱导出具有多重抗生素耐受表型的0545mut菌株,通过基因编辑技术证明NWMN＿0545和cpa1-1与耐受表型具有直接联系。通过测定0545mut菌株胞外p H变化,不同p H以及高Na+/K+浓度条件下Newman野生型对抗生素的表型,证明Na+/H+反转运功能的降低可以介导金黄色葡萄球菌出现对抗生素的多重耐受表型,并探索出“抗生素→NWMN＿0545突变→Na+/H+反转运功能下降（cpa1-1表达量降低）→抗生素多重耐受表型”这样的调控通路。金黄色葡萄球菌抗生素耐受机制的阐明为有效治疗奶牛乳腺炎感染提供理论基础;也为减少抗生素滥用,促进奶牛健康养殖模式发展提供理论依据。