论文部分内容阅读
背景及目的:胃癌是我国常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率都很高,手术和化疗是主要的治疗方式。在各种化疗药物中,铂类是胃癌治疗的常用药物,如顺铂、奥沙利铂,它们属于DNA烷化剂,进入细胞后会形成铂类-DNA加合物,导致DNA发生链内和链间交联,损伤DNA。一般认为DNA损伤是通过诱导内源性的凋亡途径而导致细胞死亡的,然而越来越多的证据表明铂类药物的作用机制可能不止是凋亡,坏死也可能参与其中。长久以来坏死被认为是由外界压倒性刺激因素引起的被动的、意外的、无序的死亡方式,和凋亡的有序调控相比,其作用一直被忽视。2005年,Degterev等在小鼠缺血再灌注损伤模型中提出程序性坏死(necroptosis)的概念,并鉴定出一种特异的抑制剂necrostatin-1(Nec-1),颠覆了人们对坏死的认识。这十年里,程序性坏死被发现参与了许多病理生理过程,且多种因素都可以引起程序性坏死的发生。尽管目前对它的信号通路还不清楚,但是也取得了一些成果,其中最主要的是肿瘤坏死因子家族引起的受体相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase 3,RIP3)依赖的途径和DNA烷化剂引起的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(poly[ADP-ribose]polymerase-1,PARP-1)介导的途径。在前期的工作中,我们使用Nec-1这个工具,发现它能显著地抑制奥沙利铂诱导的SGC-7901胃癌细胞死亡,这令我们相信奥沙利铂作用后引起的主要是坏死。本研究拟探索奥沙利铂诱导胃癌细胞死亡的方式,尤其是坏死在其中的作用,剖析RIP3依赖的途径和PARP-1介导的途径在其中的参与情况。凋亡和坏死可能是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡中普遍存在的两种结局,相对于研究得非常透彻的凋亡,坏死无疑是个新的未知领域。弄清楚坏死的发生过程,明确它和凋亡之间的关联,找到更有效地杀死肿瘤细胞的办法,将为克服肿瘤细胞对化疗药物的抵抗提供新思路。方法:Annexin V/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡和坏死;Hoechst 33342/PI染色荧光显微镜观察细胞核和细胞膜的变化;JC-1染色流式细胞术分析线粒体膜电位的改变;Western blot检测caspase-9、caspase-3、PARP-1的活化以及抗凋亡的Bcl-2家族蛋白和IAP家族蛋白的变化;提取细胞DNA,琼脂糖凝胶电泳观察DNA ladder是否出现;比色法检测细胞培养上清中的LDH活性;Western blot检测Cyp A和HMGB1的释放;透射电镜观察细胞的超微结构;DCF-DA染色流式细胞术检测细胞内的ROS水平;Western blot检测LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变;实时定量PCR和Western blot检测Bmf在m RNA和蛋白表达水平的变化;MTS法检测RIP1的抑制剂(Nec-1)、MLKL抑制剂(NSA)、Drp1抑制剂(Mdivi-1)、广谱caspases抑制剂(z-VAD-fmk)和PARP-1抑制剂(olaparib)对奥沙利铂所致SGC-7901细胞死亡的影响;转染RIP1 si RNA、RIP3 si RNA和PARP-1 si RNA后用实时定量PCR和Western blot方法验证转染效果,MTS法检测转染后对细胞死亡的影响;荧光显微镜和Western blot方法观察PAR的形成和H2AX的磷酸化;比色法检测细胞内NAD+水平;荧光素/荧光素酶法检测细胞的ATP水平;激光共聚焦显微镜和Western blot方法观察t AIF的移位;Western blot检测奥沙利铂作用早期p38、JNK和ERK1/2的磷酸化(活化)情况;MTS法检测分别用p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125或位于ERK1/2上游的激酶MEK1/2抑制剂U0126预处理对奥沙利铂所致细胞死亡的影响。结果:奥沙利铂处理SGC-7901细胞后,大多数细胞表现为Annexin V(+)/PI(+),少数为Annexin V(+)/PI(-);Hoechst 33342/PI染色见细胞核固缩、碎裂,红色荧光出现,说明细胞膜破裂;琼脂糖凝胶电泳没有观察到DNA ladder,只是在48 h出现弥散状的条带;线粒体膜电位随着奥沙利铂作用时间延长而逐渐下降;caspase-9、caspase-3的活化和PARP-1的裂解出现在奥沙利铂作用24 h后;Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、c IAP1和c IAP2在奥沙利铂处理前后没有明显改变,唯有XIAP有所下降;z-VAD-fmk能部分地抑制奥沙利铂引起的细胞死亡;奥沙利铂处理36 h后细胞培养上清中的LDH活性显著升高;Cyp A在处理后36 h释放入上清,比HMGB1要早;透射电镜观察到细胞膜完整性丧失、细胞内容物外漏、染色质固缩;坏死过程不伴有ROS的升高和自噬的发生,而Bmf在m RNA和蛋白水平均逐渐升高;Nec-1能显著地抑制奥沙利铂所致的细胞死亡,能使细胞存活率达到90%以上,而NSA或Mdivi-1对细胞死亡无影响;Nec-1还能抑制LDH和Cyp A、HMGB1释放入上清;转染RIP1 si RNA后能部分抑制奥沙利铂引起的细胞死亡,而转染RIP3 si RNA对细胞死亡无影响;大分子聚合物PAR在奥沙利铂作用后形成;细胞内NAD+和ATP水平随着奥沙利铂作用时间延长而快速下降;奥沙利铂引起组蛋白H2AX在Ser139位点发生磷酸化;t AIF在奥沙利铂处理后从线粒体移出,进入细胞浆,最终进入细胞核;olaparib能通过抑制PARP-1的活化而抵抗奥沙利铂所致的细胞死亡,并能阻止LDH释放、NAD+和ATP的下降以及t AIF的移位;转染PARP-1 si RNA也能抑制奥沙利铂引起的细胞坏死;奥沙利铂处理6 h后p38发生磷酸化,而ERK1/2和JNK在未处理的SGC-7901细胞中就处于磷酸化状态,奥沙利铂处理6 h后p ERK1/2降低,p JNK没有明显的变化;U0126或SB203580预处理可以增加细胞存活率,而SP600125对奥沙利铂所致的细胞死亡无影响。结论:奥沙利铂能诱导胃癌细胞SGC-7901发生凋亡和坏死;尽管caspase级联反应被激活,但caspase活化的程度有限,凋亡似乎是可有可无的,而坏死才是主要的死亡方式;这种坏死不伴有ROS的升高和自噬的发生,但却可以上调Bmf的表达;RIP1是该信号通路中的关键分子,Nec-1几乎能完全阻止细胞死亡;RIP3及其下游的MLKL、PGAM5以及Drp1并不参与坏死信号传导;奥沙利铂通过激活PARP-1而消耗细胞内的能量是导致坏死的原因,抑制PARP-1就可以抑制坏死的发生;H2AX在Ser139位点发生磷酸化和t AIF从线粒体移位到细胞核参与了奥沙利铂引起的SGC-7901细胞坏死过程;JNK通路不是奥沙利铂引起SGC-7901细胞坏死中所必需的,而p38通路和ERK1/2通路参与了这一死亡过程。