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背景和目的有关肝、肾等纤维化疾病的研究表明,肌成纤维细胞是分泌胶原纤维的主效应细胞,上皮间质转分化是其主要来源之一。矽肺的发病机制并不完全清楚,但已知矽肺的纤维化过程中,肌成纤维细胞同样是合成、分泌胶原纤维的主效应细胞。肌成纤维细胞的来源除了肺内固有的成纤维细胞外,其他来源也同样受到重视。肺泡Ⅱ型上皮细胞具有一定的分化能力,有可能是肌成纤维细胞的潜在来源之一。迄今为止,在矽肺过程中,二氧化硅(Si O2)粉尘如何诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化为肌成纤维细胞的机制、效率以及转分化标志物的时间-效应关系尚不确定。因此,本研究构建了体外共培养模型和大鼠矽肺模型,应用电子透射电镜、实时荧光定量PCR、激光共聚焦成像、Western blot等实验技术,探索体内外肺泡Ⅱ型上皮细胞发生EMT的过程及其时间-效应关系,为矽肺的机制阐释提供了新的思路,为矽肺的监测和干预提供了参考。方法1.提取原代肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)和AM,购买肺泡Ⅱ型上皮细胞株(RLE-6TN),并对AECⅡ和RLE-6TN进行电子透射鉴定。通过CCK-8实验,用1~140μg/mL的SiO2浓度梯度染尘24、48和72h,确定染尘浓度。2.建立体外共培养模型,AECⅡ细胞分为对照组和实验组,RLE-6TN分为直接对照组、直接染尘组、间接对照组和间接染尘组。采用western blot和qRT-PCR技术测定不同分组24、48和72h时AECⅡ和RLE-6TN中GAPDH、E-cad和α-SMA的蛋白和mRNA的相对表达水平;采用酶联免疫吸附法(ELISA)技术测定24、48和72h时AECⅡ、RLE-6TN的细胞培养上清液中TGF-β1的含量。3.建立大鼠矽肺模型,选择SPF级4~6周龄的雄性健康SD大鼠84只,体重在160~180g之间,购于河南省实验动物中心,通过非气管暴露法进行SiO2染尘,实验分为对照组和染尘组,对照给予等量的生理盐水,每组6只,并在实验的1、2、3、4、6、9和12周时处死相应的大鼠。采用HE染色法判断大鼠矽肺模型是否成功;采用激光共聚焦荧光双染技术,检测肺组织冰冻切片中E-cad和α-SMA的定位及表达水平,采用ELISA测定大鼠矽肺组织研磨液中TGF-β1的含量。4.统计分析:采用SPSS21.0软件分析实验数据。计量资料经正态性检验服从正态分布,数据以均值加减标准差(χ±s)表示,双因素数据采用重复测量资料的方差分析,单因素数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA),均数的两两比较采用最小显著差法(LSD检验),检验水准α=0.05。结果1.原代AECⅡ和RLE-6TN的电子透射电镜显示,细胞结构内均可见特异性的板层小体。CCK-8测定SiO2对细胞抑制率显示,同一染毒条件下随着时间的延长,抑制作用越强,同一染尘时间时,随着染尘浓度的增大抑制作用增强,约在最长染尘时间72h时抑制率达到50%,此时的SiO2浓度约为100μg/mL。2.原代AECⅡ的实验组和对照组相比,蛋白E-cad和α-SMA的相对表达水平的差异显著(P<0.05),实验组E-cad和α-SMA的相对表达水平随着时间的延长呈现明显的时间-效应关系。实验组和对照组培养细胞的上清液中TGF-β1的含量的差异具有统计学意义(P<0.05),并且实验组TGF-β1的变化具有明显的时间-效应关系,其最大值为1.42ng/mL。3.RLE-6TN细胞的直接染尘组与直接对照组、间接染尘组与间接对照组相比,E-cad和α-SMA的蛋白和mRNA水平的差异均具有统计学意义(P<0.05),且具有明显的时间-效应关系;直接染尘组和间接染尘组均可使E-cad的蛋白和mRNA水平表达下降而α-SMA的表达上升,间接染尘组E-cad下降和α-SMA上升的时间早于直接染尘组。细胞培养上清液中,TGF-β1的含量在直接染尘组与直接对照组、间接染尘组与间接对照组差异显著(P<0.05),间接染尘组和直接染尘组中均具有明显的时间-效应关系,其最大值为1.81ng/mL。4.HE染色显示,在2周时可见染尘组肺组织有明显的炎性细胞聚集,3周时肌纤维逐渐减少,胶原纤维增多,特别是在3周以后,可见胶原纤维聚集成团,形成细胞性结节,6周有纤维性结节出现,之后结节逐渐增大融合,甚至出现肺间隔断裂。染尘组肺组织研磨液中TGF-β1的含量在2周时达到最大值,呈现先升高后下降的趋势;免疫荧光双染显示对照组和实验组在2周时E-cad的表达达到最大值,之后逐渐下降,而α-SMA呈现随时间逐渐上升的趋势。结论游离SiO2粉尘可诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞发生EMT,转分化为肌成纤维细胞。在巨噬细胞同时存在的条件下更易于发生EMT,这可能与巨噬细胞分泌的细胞因子TGF-β有关。