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乙醛酸甲酯是一种广泛应用于医药、化工等领域的重要中间体。乙醛酸甲酯可用于合成新型的治疗基因Ⅰ型的丙型肝炎感染药物雷迪帕韦,也可用于合成泛酸的前体—D-泛解酸内酯。化学法生产乙醛酸甲酯需要在高温、高压下进行而且容易过度氧化,生物法工艺条件温和,环境污染小,副产物少,具有重要的研究价值以及广阔的应用前景。乙醇酸氧化酶（Glycolate oxidase,GO,EC 1.1.3.15）催化乙醇酸甲酯氧化生成乙醛酸甲酯。天然酶的性质往往并不能满足生产的需求,对特定的底物催化活力低,而高活性的乙醇酸氧化酶是酶法生产乙醛酸甲酯的基础。本论文首先选取菠菜来源的乙醇酸氧化酶基因在大肠杆菌中重组表达,并运用蛋白质工程手段对该乙醇酸氧化酶进行分子改造,以提高其催化活力。其次,利用融合表达技术获得的多功能酶来促进可溶性表达,并进一步提升催化表现。将过氧化氢酶和血红蛋白与乙醇酸氧化酶进行融合,并对融合酶的连接肽进行优化,最终成功获得表达高催化活性融合酶的重组菌。最终,以表达高催化活性融合酶的重组菌为生物催化剂,构建酶法生产乙醛酸甲酯的反应体系并对其反应条件进行了优化。具体的内容包括:（1）通过易错PCR法对乙醇酸氧化酶基因进行扩增,扩增产物重组在表达载体p ET-28a中,并导入E.coli BL21（DE3）感受态细胞,利用Fe2+显色剂构建乙醇酸氧化酶突变体的高通量筛选体系获得突变子,并结合液相色谱筛选得到催化活力显著提高的突变体M267S/S362G。在此基础上,又将两个突变位点进行了点饱和突变,通过筛选验证获得更优组合突变子M267T/S362G,其对乙醇酸甲酯的催化活力为天然酶的1.78倍。（2）将乙醇酸氧化酶GO基因、过氧化氢酶CAT基因以及血红蛋白Vs HGB基因融合表达,选择血红蛋白-乙醇酸氧化酶-过氧化氢酶和过氧化氢酶-乙醇酸氧化酶-血红蛋白两种连接顺序以及GSG和GGGGS两种不同的连接肽,通过重叠PCR延伸拼接法构建了八种正确连接的融合酶基因,八种融合基因在大肠杆菌中都得以成功表达并表现出乙醇酸氧化酶催化活性。SDS-PAGE中不同组合的融合酶的条带与理论值112 k Da一致。将融合酶应用于催化乙醇酸甲酯氧化合成乙醛酸甲酯,结果表明八种不同组合融合酶催化的乙醛酸甲酯得率相对单一乙醇酸氧化酶单酶都获得较大的提升,其中融合酶Vs HGB-GSG-GO-GGGGS-CAT显示最高的催化活性。反应4 h后,融合酶Vs HGB-GSG-GO-GGGGS-CAT催化乙醇酸甲酯氧化的得率为67.8%,较乙醇酸氧化酶单酶催化时的得率提高了5.29倍。（3）以突变体M267T/S362G(GOmut)、过氧化氢酶和血红蛋白构建融合酶,对含突变体的融合酶Vs HGB-GSG-GOMut-GGGGS-CAT的诱导条件进行优化,当IPTG浓度为0.6 m M,诱导温度为20℃时,诱导表达的乙醇酸氧化酶活力最高为0.1035 U/m L。以表达融合酶Vs HGB-GSG-GOMut-GGGGS-CAT的大肠杆菌细胞制备粗酶液作为生物催化剂,以乙醇酸甲酯为底物,探究不同催化条件包括反应时间、通氧速率、反应温度、缓冲液p H和乙醇酸甲酯浓度对乙醛酸甲酯得率的影响。确定最佳的反应条件为:氧气速率为1 L/h,反应温度为15℃,缓冲液p H为8.0,反应时间为6 h。在上述优化条件下,当底物乙醇酸甲酯浓度为200 m M时,乙醛酸甲酯得率达95.37%。