葡激酶（Staphylokinase,Sak）是由某些金黄色葡萄球菌产生的具有活化纤溶酶原作用的蛋白质。Sak与纤溶酶原结合,形成1:1的复合物,发挥激活纤溶酶原的作用。Sak具有纤维蛋白特异性高,不激活系统性纤溶,无出血危险;溶栓效果好,对富含血小板的动脉血栓效果尤为突出;分子量小,穿透性能好等优点,因而成为一种具有良好应用前景的溶栓药物。但Sak存在有免疫原性、循环半衰期短等缺点,本研究期望能通过提高Sak活性从一定程度上缓解这些矛盾。 近年来发展起来的体外定向进化技术,可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下,通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛选,获得具有改进功能或全新功能的蛋白质。该技术可用于任何有合适筛选或选择方法的蛋白质的改造,是改造治疗性蛋白质的强有力手段。本研究运用体外定向进化的方法对野生型Sak进行改造,探索简便、有效、优化的Sak体外定向进化的技术路线,筛选活性增高的Sak突变体。 首先,本研究采用易错PCR法对野生型sak基因进行随机诱变,建立随机突变库,筛选活性提高的突变体。在反应体系中添加Mn²⁺,提高Mg²⁺浓度至3mmol/L,使用不平衡的各种dNTP:0.2mmol/L dATP和dGTP,1mmol/L dCTP和dTTP,通过调整Mn²⁺的浓度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L）来调节突变率,随机抽样测序的结果表明,Mn²⁺的浓度为0.15mmol/L时突变率为0.56%,活性克隆约占70%。用血浆琼脂平板法筛选出大约10000个活性克隆,其中挑选出100个溶圈较大的克隆作为潜在高活力克隆,用纤维蛋白琼脂平板打孔法重复筛选。获得活性为野生型Sak2倍的突变株2株,1.5倍的突变株1株。 以三株良性突变体的基因为亲本进行DNA改组,建立改组文库,用血浆琼脂平板法筛选,活性克隆约占70%,筛选到大约10000个活性克隆,从中挑选出100个溶圈较大的克隆作为潜在高活力克隆,用纤维蛋白琼脂平板打孔法进行重复筛选,未筛选到活性进一步提高的克隆。从100个克隆中随机挑选了10个克隆进行测序,随机突变频率为0.35%,其中两个突变子发生不同亲本之间的重组。 用交错延伸技术对三株良性突变体的基因进行重组,建立重组文库,用血浆琼脂平板法筛选,活性克隆约占90%,筛选到大约10000个活性克隆,从中挑