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目的:
分别建立去卵巢大鼠骨质疏松模型、D-半乳糖致雄性大鼠骨质疏松模型,采用骨形态计量学方法、生物力学等观察人参花蕾对大鼠骨组织的影响,并分别探讨其作用机理。
方法:
1.人参花蕾防治去卵巢大鼠骨质疏松试验
选取5月龄未交配雌性SD大鼠60只,随机分为6组。除假手术组外,其余行双侧卵巢切除术。假手术组(Sham)和去卵巢组(OVX)给予溶剂对照,其余组分别予:利维爱(0.225mg/kg/d,LV)、仙灵骨葆(270mg/kg/d,GB)、低剂量人参花蕾(0.486g/kg/d,GF(L))、高剂量人参花蕾(2.43g/kg/d,GF(H)),均灌胃给药,连续12周。
所有大鼠在处死前14、13天和4、3天分别皮下注射盐酸四环素(25mg/kg)和钙黄绿素(5mg/kg)进行荧光标记。大鼠处死后取左侧胫骨上段、第五腰椎和胫骨中段进行不脱钙包埋后分别制成骨切片和骨磨片,通过半自动图像分析系统进行骨组织形态计量学测量;用858 Mini Bionix型材料测试系统分析大鼠右侧股骨(三点弯曲法)的生物力学性能;将左侧尺骨烘干、消化,分成两份,检测其骨钙、磷以及骨胶原的含量。
2.人参花蕾防治D-半乳糖致雄性大鼠骨质疏松试验
3月龄的清洁级雄性SD大鼠53只,随机分为5组,除正常对照组颈背部皮下注射生理盐水5ml/kg/d外;其余组颈背部皮下注射D-半乳糖100mg/kg/d。正常对照组(NS,13只)和D-半乳糖模型组(DG,10只)给予溶剂对照,其余组分别予:复方司坦唑醇(司坦唑醇0.54mg/kg/d+吡拉西坦432mg/kg/d,CP,10只)、低剂量人参花蕾(0.486g/kg/d,GF(L),10只)、高剂量人参花蕾(2.43g/kg/d,GF(H),10只),均灌胃给药,连续14周。
雄性大鼠除用左侧股骨检测其骨钙、磷以及骨胶原的含量外,其他处理均同去卵巢实验大鼠。
结果:
1人参花蕾防治去卵巢大鼠骨质疏松试验
1.1去卵巢对雌性大鼠骨组织的影响
1.1.1胫骨上段松质骨的变化
与Sham组比较,OVX大鼠胫骨上段骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)、骨小梁数量(Tb.N)分别降低了63.9%(P<0.01)、60.5%(P<0.01)。骨吸收参数每毫米破骨细胞数(Oc.N/mm)增加了143.2%(P<0.05)。骨形成参数%L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV分别增加了139.4%(P<0.05)、39.1%(P<0.05)、249.5%(P<0.05)、303.8%(P<0.05)。
1.1.2腰椎松质骨的变化
与Sham组比较,OVX大鼠腰椎%Tb.Ar、Tb.Th分别降低了41.9%(P<0.01)、38.0%(P<0.01),Tb.Sp增加了31.1%(P<0.05)。骨形成及骨吸收参数变化不明显。
1.1.3胫骨中段皮质骨的变化
与Sham组比较,OVX大鼠胫骨中段的%Ct.Ar下降了4.1%(P<0.05),%Ma.Ar增加了16.3%(P<0.05);骨内膜的%E-L.Pm增加了273.7%(P<0.01),骨外膜的动态参数无明显变化。
1.1.4股骨生物力学性能的变化
与Sham组比较,OVX大鼠股骨的弹性载荷、最大载荷、断裂载荷分别下降了19.7%(P<0.01)、13.0%(P<0.01)、10.6%(P<0.05),其他生物力学指标无明显变化。
1.1.5尺骨的变化
与Sham组比较,OVX大鼠尺骨的湿重/体重比(BWW/BW)、干重/体重比(BDW/BW)分别降低13.2%(P<0.01)、11.9%(P<0.01),但尺骨生化指标均无明显变化。
1.2利维爱对去卵巢大鼠骨组织的影响
1.2.1胫骨上段松质骨的变化
与OVX组比较,利维爱组Oc.N/mm减少了68.2%(P<0.05)。%L-Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV分别降低了81.6%(P<0.01)、25.8%(P<0.05)、85.0%(P<0.01)、86.4%(P<0.01),但静态参数无明显变化。
1.2.2腰椎松质骨的变化
与OVX组比较,利维爱组骨小梁分离度(Tb.Sp)下降了18.2%(P<0.05),但其他参数均无明显变化。
1.2.3胫骨中段皮质骨的变化
与OVX组比较,利维爱组骨内膜的%E-L.Pm降低59.2%(P<0.01),但其他参数均无明显变化。
1.2.4股骨生物力学性能的变化
与OVX组比较,利维爱组股骨弹性载荷、最大载荷、断裂载荷和刚性系数分别增加了65.9%(P<0.01)、17.3%(P<0.01)、16.0%(P<0.01)、129.8%(P<0.01)。
1.2.5尺骨的变化
与OVX组比较,利维爱组尺骨的BWW/BW、BDW/BW分别增加23.9%(P<0.01)、24.3%(P<0.01),单位骨干重中的骨钙含量增加128.5%(P<0.05),Ca/Hyp增加155.0%(P<0.05)。
1.3仙灵骨葆对去卵巢大鼠骨组织的影响
1.3.1胫骨上段松质骨的变化
与OVX组比较,仙灵骨葆组胫骨上段的静态参数中%Tb.Ar、Tb.Th分别提高了62.6%(P<0.05)、26.6%(P<0.01);骨形成参数MAR、BFR/BV分别降低了30.4%(P<0.01)、36.4%(P<0.05);但骨吸收参数无明显变化。
1.3.2腰椎松质骨的变化
与OVX组比较,仙灵骨葆组骨小梁厚度(Tb.Th)增加了30.0%(P<0.01),但其他参数均无明显变化。
1.3.3胫骨中段皮质骨的变化
与OVX组比较,仙灵骨葆组胫骨中段皮质骨的Ct.Ar增加14.3%(P<0.01),但其他参数均无明显变化。
1.3.4股骨生物力学性能的变化
与OVX组比较,仙灵骨葆组股骨弹性载荷、最大载荷、断裂载荷和刚性系数分别增加了41.5%(P<0.01)、16.6%(P<0.01)、11.6%(P<0.05)、59.1%(P<0.05),其他生物力学指标无明显变化。
1.3.5尺骨的变化
与OVX组比较,仙灵骨葆组尺骨物理指标和生化指标均无显著变化。
1.4人参花蕾对去卵巢大鼠骨组织的影响
1.4.1胫骨上段松质骨的变化
与OVX组比较,低剂量的人参花蕾可使去卵巢大鼠胫骨上段Tb.N增加47.1%(P<0.05),而使%L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV分别降低了60.8%(P<0.05)、21.9%(P<0.01)、68.6%(P<0.05)、72.6%(P<0.01),但骨吸收参数无明显变化。高剂量的人参花蕾使%Tb.Ar、Tb.Th分别增加64.8%(P<0.05)、21.7%(P<0.01),使Oc.N/mm、%L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV分别减少了65.4%(P<0.05)、75.3%(P<0.01)、44.5%(P<0.01)、85.6%(P<0.01)、88.8%(P<0.01)。
1.4.2腰椎松质骨的变化
与OVX组比较,低剂量组的%Tb.Ar、Tb.Th分别增加了49.3%(P<0.01)、36.5%(P<0.01),而Tb.Sp下降了19.1%(P<0.05);高剂量组的Tb.Th增加了28.3%(P<0.01)。低、高剂量组骨形成及骨吸收的参数变化均不明显。
1.4.3胫骨中段皮质骨的变化
与OVX组比较,低、高剂量组人参花蕾大鼠的%Ct.Ar分别增加4.6%(P<0.01)、4.3%(P<0.01),%Ma.Ar分别下降14.8%(P<0.01)和14.0%(P<0.01);低、高剂量组的%E-L.Pm分别下降43.7%(P<0.05)和69.0%(P<0.01);%P-L.Pm、P-MAR、P-FBR/BS、E-MAR和E-FBR/BS均无明显变化。
1.4.4股骨生物力学性能的变化
与OVX组比较,低剂量组的刚性系数增加139.7%(P<0.01),高剂量组刚性系数、弹性载荷分别增加139.7%(P<0.01),22.4%(P<0.05),其他生物力学指标无明显变化。
1.4.5尺骨的变化
与OVX组比较,低剂量组尺骨的BWW/BW、BDW/BW、Ca/Hyp分别增加8.7%(P<0.05)、8.1%(P<0.05),82.5%(P<0.05);高剂量组尺骨的BWW/BW、BDW/BW分别增加13.0%(P<0.01)、13.5%(P<0.01)。
2人参花蕾防治D-半乳糖致雄性大鼠骨质疏松试验
2.1 D-半乳糖对雄性大鼠骨组织的影响
2.1.1胫骨上段松质骨的变化
与NS组比较,DG大鼠的%Tb.Ar、Tb.Th分别降低了30.1%(P<0.01)、10.2%(P<0.05),Tb.Sp增加了38.7%(P<0.01)。骨吸收参数方面,Oc.N/mm、%Oc.S.Pm分别增加了102.9%(P<0.01)和113.3%(P<0.01)。反映骨形成及骨矿化的参数变化不明显。
2.1.2胫骨中段皮质骨的变化
与NS组比较,DG大鼠的%Ct.Ar)下降3.9%(P<0.01),%Ma.Ar增加16.4%(P<0.01)。骨内外膜的形成和矿化均无明显变化。
2.1.3股骨的理化特征及力学性能的变化
与NS组比较,DG大鼠股骨BWW/BW、BDW/BW明显降低(P<0.05),骨钙含量下降46.1%(P<0.05)。弹性载荷下降了10.4%(P<0.05),其它骨生物力学指标无明显变化。
2.2阳性对照药复方司坦唑醇对D-半乳糖雄性大鼠骨组织的影响
2.2.1胫骨上段骨的变化
与DG组比较,CP组的%Tb.Ar、Tb.N分别升高了57.8%(P<0.01)、45.0%(P<0.01),Tb.Sp减少了36.1%(P<0.01)。骨吸收参数方面,Oc.N/mm和%Oc.S.Pm分别减少了65.9%(P<0.01)和68.8%(P<0.01)。反映骨形成及骨矿化的指标变化不明显。
2.2.2胫骨中段皮质骨的变化
与DG组比较,CP组的骨外膜的%P-L.Pm、P-MAR、P-BFR/BS分别下降了36.9%(P<0.05)、27.8%(P<0.05)、56.1%(P<0.05),骨内膜的动态参数无明显变化。皮质骨骨量、骨髓腔大小无明显变化,
2.2.3股骨的理化特征及力学性能的变化
与DG组比较,CP组的BDW/BW明显增加(P<0.05),弹性载荷增加了11.4%(P<0.05),其它骨生物力学指标无明显变化。
2.3人参花蕾对D-半乳糖雄性大鼠骨组织的影响
2.3.1胫骨上段松质骨的变化
与DG组比较,低、高剂量的人参花蕾分别使胫骨上段静态参数中的%Tb.Ar增加36.3%(P<0.05)和44.1%(P<0.01),Tb.Sp减少了24.7%(P<0.05)和27.2%(P<0.01)。低剂量组的Oc.N/mm和%Oc.S.Pm分别减少了55.1%(P<0.05)和65.6%(P<0.01),高剂量组的Oc.N/mm和%Oc.S.Pm分别减少了77.5%(P<0.01)和84.4%(P<0.01)。反映骨形成参数变化不明显。
2.3.2胫骨中段皮质骨的变化
与DG组比较,低剂量组人参花蕾的%Ct.Ar增加3.6%(P<0.05)、%Ma.Ar下降12.3%(P<0.05),高剂量组人参花蕾的Ct.Ar、%Ct.Ar分别增加10.2%(P<0.05)、3.8%(P<0.05)、%Ma.Ar下降12.8%(P<0.05)。骨内外膜的动态参数均无明显变化。
2.3.3股骨的变化
与DG组比较,低、高剂量组股骨BWW/BW明显降低(P<0.05),弹性载荷增加17.9(P<0.01),其它骨生物力学指标无明显变化。
结论:
1.5月龄SD雌性大鼠去除卵巢12周后,可产生高转换型骨质疏松。胫骨上段、腰椎松质骨和胫骨中段皮质骨的骨量明显丢失,骨显微结构退化,骨力学质量有所下降。利维爱使去卵巢大鼠股骨的生物力学性能增强,对抗去卵巢大鼠尺骨的无机质丢失;仙灵骨葆能有效对抗去卵巢大鼠胫骨上段松质骨的丢失增强股骨的生物力学性能,但对胫骨中段皮质骨和腰椎骨丢失的作用不明显。低、高剂量的人参花蕾能够对抗去卵巢引起大鼠骨丢失,预防骨质疏松,低剂量对胫骨中段皮质骨和腰椎作用明显,高剂量对胫骨上段和胫骨中段皮质骨作用明显。
2.每天连续给予皮下注射D-半乳糖100mg/kg14周,可明显促进破骨细胞的骨吸收功能,导致骨明显丢失;阳性对照药物复方司坦唑醇有效预防D-半乳糖导致大鼠骨丢失的改变;低、高剂量的人参花蕾都是通过抑制破骨细胞的骨吸收来有效预防D-半乳糖导致雄性大鼠的骨改变,能有效对抗D-半乳糖大鼠胫骨上段和中段骨的丢失,但对股骨无机质丢失的预防作用不明显,高、低剂量效果相当,有望成为理想的抗骨质疏松药物。