研究背景及目的肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是指由多种病因引起的具有相似病理过程的一类弥漫性肺间质疾病，其病理特征是早期有肺泡结构破坏和弥漫性肺泡炎，继后出现细胞外基质过度沉积，并逐渐演变为弥漫性肺间质纤维化，从而造成肺功能障碍，病人多死于进行性加重的肺纤维化所致的呼吸衰竭。由于发病率逐年增加，发病机制尚未完全明了，缺乏有效的治疗药物，死亡率高。传统的糖皮质激素和细胞毒药物疗效不能令人满意。故寻找行之有效的治疗药物是目前医疗界迫切需要解决的问题。最近研究表明，姜黄素具有广泛的药理作用，如抗炎、抗氧化、抗缺血、抗癌和抗肝纤维化等。为了探讨姜黄素对大鼠肺纤维化的防治作用，本实验采用博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型，从整体、细胞与分子水平研究其防治肺纤维化的疗效和作用机制，为临床治疗提供实验基础。研究方法及结果1整体动物实验1．1方法SD雄性大鼠144只，体重（198±7）g，分为假手术组，模型组，姜黄素高、中、低剂量组，醋酸泼尼松组，每组24只，共6组。除假手术组外其余各组大鼠气管内一次性滴注盐酸博莱霉素，假手术组大鼠气管内一次性滴注等体积的生理盐水。造模后第1天开始灌胃给药，持续到处死动物的前一天。姜黄素高、中、低剂量组分别为200、100、50mg·kg^-1·d^-1，醋酸泼尼松组（阳性药物对照组）剂量为0.56 mg·kg^-1·d^-1，假手术组，模型组分别灌服等体积的生理盐水。各组动物于实验第7，14，28d分三批处死，每组6只常规制成光镜标本，HE和Mallory染色，2只麻醉后快速开胸取肺组织，迅速投入液氮冷冻，以备免疫组化、western blot以及电镜标本的制作。免疫组化载玻片用DEPC处理后备用。普通透射电镜标本常规制作。钌红特殊染色透射电镜标本的制作，使用钌红前固定液和后固定液特殊固定处理，其余包埋，超薄切片制作同透射电镜。将肺组织分为无染色区、深染色区和浅染色区，计算机图像分析，采用美国Image-Pro Plus 5.0图像分析系统，自动测出各部分所占面积，取其平均值（mm²），用SPSS11.5软件进行统计学处理。1．2结果HE染色结果：7d、14d、28d时假手术组肺组织结构未见异常。7d时，模型组大鼠肺毛细血管充血，肺泡隔增宽且水肿，有大量中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润，可见散在的位于肺间隔和细小支气管周围的纤维增生灶；醋酸泼尼松组肺泡腔有炎性细胞渗出，可见胸膜有渗出和增厚，其余各组未见此变化；姜黄素高、中、低剂量组都表现出不同程度的炎症。14d时除模型组外各组炎症减轻和出现不同程度的纤维化灶。28d时，各组炎症明显消退，个别区域仍有极少量炎症细胞存留。模型组大鼠纤维化程度明显，有大片实变区，呈中重度肺纤维化改变，表明动物模型复制成功。阳性药物组情况略好，肺泡隔部分纤维化。姜黄素高、中、低剂量组情况明显好转，肺泡隔纤维增生灶较少，肺泡内未见明显的炎性细胞。细小支气管周围的纤维化程度明显低于模型组及醋酸泼尼松组，其中姜黄素高、中剂量组更轻，以中剂量组效果最佳，仅存有极少量的小纤维灶，肺泡结构已经基本修复。表明姜黄素在一定程度上有减轻大鼠肺损伤性肺泡炎或阻抑肺纤维化的作用。Mallory染色结果证实：姜黄素高、中、低剂量组在14d和28d时肺泡隔增生不明显，纤维化程度轻微。特别是中剂量组病变程度较轻，纤维化程度轻，胶原总含量明显少。形态定量分析结果显示：模型组与假手术组相比，形态定量分析结果与组织病理学检查一致。姜黄素中、低剂量组在7d时有一定的抗炎作用，14d、28d时有明显抑制盐酸博莱霉素所致大鼠肺纤维形成作用，中剂量组效果最佳（p＜0.01）。超微结构观察发现：姜黄素各组肺组织结构较模型组完整，大部分上皮细胞的基膜完整，成纤维细胞增生、间质胶原纤维沉积范围及程度均较模型组减轻。用western-blot和免疫组化的方法，研究姜黄素对肺组织TNF-a的影响。结果显示：姜黄素能降低肺纤维化大鼠肺组织TNF-a的含量。对肺外因素——循环纤维细胞（circulating fibrocyte）的初步研究采用免疫组化双标法观察大鼠肺组织内CD45和colⅠ的表达，结果发现：博来霉素组肺纤维化灶内的循环纤维细胞明显比正常对照组数量多，表明循环纤维细胞在博莱霉素诱导大鼠所致肺纤维化形成过程中起重要作用。2体外实验研究2．1方法建立肺纤维化模型同前，采用组织块培养法原代培养肺间质成纤维细胞，反复贴壁纯化。以传代5-8代的成纤维细胞为实验对象，直接观察不同浓度的姜黄素（10、20、40、80、160μmol／L）观察姜黄素对大鼠肺成纤维细胞（LFb）增殖及分泌细胞外基质的影响。MTT法检测姜黄素对肺成纤维细胞增殖的影响，ELLISA法检测细胞培养上清中胶原Ⅰ、透明质酸，层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的含量。2．2结果姜黄素在(10-160μmol／L浓度范围内，对肺成纤维细胞无细胞毒性作用，却剂量依赖地抑制肺成纤维细胞的增殖，并不同程度抑制Ⅰ型胶原、透明质酸、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的分泌，尤以80μmol／L姜黄素效果最好。结论1姜黄素能降低博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化细胞外基质的含量，减轻纤维化的程度，从而发挥预防和治疗肺纤维化的作用。2姜黄素能抑制博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化肺泡细胞和间质细胞中TNF-a蛋白活性，从而减轻肺组织炎症反应，减少纤维的集聚和纤维化形成。3肺成纤维细胞是肺纤维化发生与发展的关键环节，姜黄素在体外能显著抑制成纤维细胞的增殖和细胞外基质的合成，从而起到抗肺纤维化的作用。4骨髓来源的循环纤维细胞，在博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化形成过程中起着重要作用，为临床治疗肺纤维化提供新思路。