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过氧化物酶体（peroxisome）是由单层膜包被的细胞器,普遍存在于真核生物的细胞中。过氧化物酶体内含有多种酶,参与多种代谢途径,主要参与脂肪酸的β氧化以及自由基的清除。细胞环境对过氧化物酶体的形态、数量以及功能有很大影响。细胞通过调控过氧化物酶体生物发生和降解之间的平衡得以实现过氧化物酶体的稳态,过氧化物酶体的分裂、增殖、传承以及蛋白转运等细胞过程被称为过氧化物酶体的生物发生;冗余或受损的过氧化物酶体的选择性降解过程被称为过氧化物酶体自噬。过氧化物酶体的自噬主要包括过氧化物酶体微自噬和过氧化物酶体巨自噬两种形式。Pex14是过氧化物酶体膜上重要的蛋白,不仅参与过氧化物酶体的生物发生,还参与过氧化物酶体的自噬过程。Pex14是一种磷酸化蛋白,在毕赤酵母中以磷酸化和非磷酸化两种状态存在,但是磷酸化Pex14的激酶、Pex14蛋白的磷酸化位点及Pex14磷酸化对过氧化物酶体生物发生和自噬的影响等问题目前还不清楚。本实验利用毕赤酵母（Pichia pastoris）Pex14磷酸化突变体菌株,通过生长曲线测定、western blot检测、荧光显微观察、体外激酶活性实验、酵母双杂交以及Co-IP等实验方法来探究Pex14的磷酸化是否影响过氧化物酶体生物发生和自噬。主要研究结果如下:1.确定毕赤酵母中Pex14关键的磷酸化位点实验室前期工作对毕赤酵母Pex14进行了磷酸化质谱测序。在甲醇诱导条件下T288,T289,S292,S385位的氨基酸可能为Pex14的磷酸化位点。我们将Pex14（T288,289,S292A）、Pex14（T288,289,S292D）、Pex14（S385A）、Pex14（S385D）等磷酸化和非磷酸化突变整合到Δpex14菌株基因组中,分析Pex14的磷酸化突变体是否参与过氧化物酶体生物发生或自噬。我们通过western blot检测各突变菌株中Pex14的分子量大小,结果发现只有Pex14 S385D的分子量比未突变的Pex14大,从而确定S385为Pex14的关键磷酸化位点。2.Pex14磷酸化对过氧化物酶体生物发生和降解的影响2.1 Pex14磷酸化不参与过氧化物酶体的生物发生我们通过对各磷酸化位点突变菌株进行生长曲线测定,发现Pex14磷酸化突变并不影响菌株在甲醇培养基和油酸培养基中的正常生长,说明Pex14磷酸化不参与过氧化物酶的生物发生。2.2 Pex14磷酸化修饰影响过氧化物酶体微自噬诱导各磷酸化突变菌株发生过氧化物酶体微自噬,在生化水平上,利用western blot检测Aox的降解情况,同时通过GFP-Cleavage实验检测GFP-Aox等融合蛋白的降解情况。生化实验发现在过氧化物酶体微自噬条件下,Δpex14::Pex14（S385D）-His和Δpex14::Pex14（T288,289,S292D）-His菌株中Aox降解显著减缓,从而确定Pex14磷酸化修饰影响过氧化物酶体微自噬。但是细胞水平上通过荧光观察只是观察的单个细胞间的差异,Pex14（S385A）和Pex14（S385D）菌株间GFP-Aox进入液泡降解的差异不如在生化水平上明显。2.3 Pex14磷酸化修饰对过氧化物酶体巨自噬及非选择性自噬影响较小诱导各磷酸化突变菌株发生过氧化物酶体巨自噬,我们通过检测过氧化物酶体巨自噬中Aox降解、GFP-Cleavage实验检测GFP-Aox降解以及荧光显微观察GFP-Pmp20降解等实验,并没有观察到Pex14 S385D对过氧化物酶体巨自噬有明显的影响。我们又诱导各突变菌株发生非选择性自噬,通过检测Aox的降解情况,同样没有观察到Pex14 S385D对非选择性自噬有明显的影响。3.通过体外激酶实验寻找磷酸化Pex14的激酶经生物信息学软件预测,蛋白激酶Ck2和Gsk3可能磷酸化毕赤酵母Pex14位于385位的丝氨酸,所以我们构建了表达载体,纯化Ck2,Gsk3和Pex14蛋白,通过体外激酶活性实验检测Ck2和Gsk3是否能够磷酸化Pex14 S385。由于Gsk3在大肠杆菌BL21菌株中形成包涵体蛋白,未能纯化到可溶性Gsk3蛋白。目前,纯化得到了His-Ckα1、GSTPex14ΔN和GST-Pex14ΔNS385A蛋白,然后利用纯化的蛋白进行体外激酶实验,放射自显影结果中显示GST-Pex14ΔN、GST-Pex14ΔNS385A均有条带,说明Ckα1可以磷酸化Pex14,但S385可能不是唯一的Ck2磷酸化位点。后续实验中,我们拟构建进一步截短的Pex14蛋白,通过激酶活性实验确定S385是否为Ckα1的磷酸化位点。4.探究Pex14磷酸化影响过氧化物酶体自噬的分子机理由western blot结果,我们已经确定Pex14磷酸化修饰会减缓过氧化物酶体微自噬,为了探究Pex14磷酸化是否通过影响与Atg30的互作从而影响过氧化物酶体微自噬,我们又进行了酵母双杂交实验检测了两者之间的互作关系。将构建好的ATG30-p GADT7和PEX14-p GBKT7质粒共同转入酿酒酵母菌株AH109,结果显示Atg30和Pex14并不互作,可能由于在酵母双杂交体系中Atg30没有被正确的修饰。所以我们计划构建载体ZEOCIN-ATG30-GFP-p IB2,然后分别转入Δpex14::Pex14（S385A）-His、Δpex14::Pex14（S385D）-His、Δpex14::Pex14-His菌株,准备利用GFP-Trap进行Co-IP实验,进一步分析Pex14磷酸化是否通过影响与Atg30的互作从而影响过氧化物酶体微自噬。