水钠潴留是高血压发病机制中的核心环节之一,肾脏对钠离子的重吸收程度与体内细胞外液及血压息息相关。肾小管是调节体内钠离子水平的关键部位,其钠转运通道的异常可直接引起水钠潴留。在过去的50年里,噻嗪类利尿剂常常被推荐为高血压临床一线药物,但开发这些药物的时候,高血压发病机理还不是十分明确。部分高血压病人疗效不佳可能与人们对钠排泄机制的理解不充分有关,近期研究发现噻嗪类利尿剂实际上是钠氯协同转运子(thiazide-sensitive Na-Clcotransporter [NCC]; SLC12A3)的特异性抑制剂。因此,探索钠氯协同转运子作用机理及调控途径对指导临床合理用药及开发新的降压药具有积极的意义。WNK激酶(With No Lysine Kinase)是近期高血压研究的一个新方向。WNK由于其在Ⅱ号亚区缺乏一个高度保守的起催化作用的赖氨酸而得名,包含四个家族成员WNK1～4、WNK1能通过MEKK2/3来磷酸化ERK5,WNK3激酶也可磷酸化SPAK (STE20/SPS1相关的富含脯氨酸/丙氨酸的激酶)。WNN4能直接抑制NCC活性,但WNK 1抑制WNN4效应,而KS-WNK1(肾脏特有的WNK1)抑制全长的WNK1,在体内形成相互牵制的动态平衡,共同调节NCC等离子通道。若WNK激酶家族的两个成员WNK1和WNK4的突变能导致一种遗传性高血压——假性醛固酮减少症Ⅱ型(Pseudohypoaldosteronism Ⅱ,PHA Ⅱ)。最近的研究表明WNK3也是调节NCC的重要成员之一,但WNK3的功能发挥与WNK4、WNK1密切相关,WNK3可拮抗WNK4的活性,反之亦然。KS-WNK1可抑制WNK3酶活性,Rinehart等报道在爪蟾卵母细胞中,采用放射性标记跟踪法(22Na流研究)发现：野生型WNK3 (WNK3-WT)可增强NCC的表达,无激酶活性的WNK3则对NCC起抑制作用。致PHAⅡ突变体WNK3对NCC的作用与WNK3-WT表现相似,提示WNK3激酶在调节血压和维持电解质平衡中代表了一种新的信号途径。我们构建了带有各种标记的WNK3和NCC质粒,转染肾小管细胞,观察WNK3与NCC在细胞上的分布和相互作用,并探索其可能调控机制和ERK通路的关系,将对阐明高血压的发病机制及开发新的噻嗪类利尿剂具有重要的现实意义,有助于设计新的高血压治疗方案,为高血压患者提供更多的副作用较少的治疗药物,从而改善高血压患者的健康。WNK3在体内参与细胞骨架形成,细胞凋亡及肿瘤细胞的侵袭转移,HEK293细胞中转染WNK3-KD(酶区域缺陷WNK3)质粒,在共聚焦显微镜下发现细胞形态皱缩,表明WNK3-KD不能维持细胞正常形态,还发现WNK1, WNK3维持细胞存活的功能在细胞面临代谢紊乱(乳酸酸中毒及细胞体积变化)时表现的更加显著。转染WT-WNK3质粒的HeLa(子宫颈癌细胞),在actinomycin-D诱导凋亡处理下的存活时间显著长于没有转染WT-WNK3质粒的HeLa,表明WNK3通过caspase-3依赖途径延长细胞存活时间,延缓细胞凋亡。肾脏是维持水和电解质平衡的重要脏器,但也极易受到缺血缺氧、药物等各种因素引起的损伤,进而引起肾脏不同细胞的功能受损,甚至细胞凋亡或坏死。已有研究显示WNK3具有其他三个家族成员中不一样的特性,例如对细胞的凋亡有一定的保护作用,如子宫颈癌细胞,神经细胞元等,其机制还不十分明确。但对人肾脏细胞的凋亡有无保护作用暂无相关报道,故而本课题还针对WNK3高表达对白介素-1β诱导HEK293细胞凋亡有无保护作用。我们研究结果表明WNK3具有保护肾脏细胞在不利条件下的生存能力,故建议在调控过程中避免过度抑制WNK3,以免影响肾脏细胞生存能力。第一部分 WNK3和NCC质粒的构建目的：构建带有HA、GFP、Myc各种标记的WNK3和NCC质粒。方法：应用试剂盒提取人全血DNA,采用50u1反应体系,应用设计好的WNK3引物,提取以人DNA为模板WNK3片段,PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳并回收纯化。选择EcoRI和Xho Ⅰ酶切位点,打开空白质粒环,作为WNK3接入点,将WNK3激酶和pCMV-HA Vector(带HA标记的空载体)各50ul体系,在PCR仪中设定37℃,运行四小时同时进行酶切,使两者可以形成互补片段。采用含T4 DNA ligase的20 ul体系在PCR仪器设置16℃过夜,连接WNK3片段和pCMV-HA Vector,制备感受态大肠杆菌,将质粒转入感受态大肠杆菌,加入SOC培养液,37℃ 225～250 rpm振荡培养至混浊,接种到培养皿上,挑选单克隆菌落,重新在大肠杆菌中扩增,使用QIAGEN Plasmid mini Kit提取质粒,将获得的重组质粒分成两份,一份进行EcoRI和Xho Ⅰ酶鉴定,酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定,并回收纯化。收集片段送Agencourt Bioscience Corporation测序,测序结果与GenBank中人WNK3基因序列进行比对。测序正确的序号对应单克隆质粒即我们的目标质粒pCMV-HA-WNK3质粒,供后续实验用。类似方法合成pCMV-Myc-WNK3、PCMV-HA-NCC、pEGFP-N1-NCC等系列质粒。并将其转染胚肾细胞HEK293和肾小管Cos-7细胞,观察其荧光及蛋白表达。结果：1)基因测序均正确；2)转染细胞后免疫荧光观察及后续实验提示质粒在细胞中表达良好。结论：我们利用基因工程成功构建了实验所需的质粒,酶切鉴定及细胞内表达均符合实验要求。第二部分 WNK3和NCC在Cos-7细胞上的分布及相互作用目的：观察WNK3、NCC在Cos-7细胞浆及细胞膜上的分布,WNK3对NCC蛋白表达的剂量效应,两者有无直接相互作用。方法：1)Cos-7细胞分2组,分别转染pEGFP-NCC+ pCMV-HA-Vector(作为对照)和pEGFP-NCC+ pCMV-HA-WNK3,培养36小时后加抗HA荧光二抗,在免疫荧光显微镜下检测两种蛋白分布。2)Cos-7细胞分3组,放置37℃细胞培养孵育箱内,24小时内观察细胞生长密度在40-50%时进行质粒DNA转染,每组中加入恒定量的HA-NCC(0.5μg/盘),HA-WNK3则按计量递增转染(分别为0.5μg、1μg、2μg/盘),其中单独转染NCC作为对照组,培养36小时细胞裂解后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后用多克隆兔抗HA抗体检测WNK3和NCC,用多克隆兔抗GAPDH抗体检测GAPDH,观察WNK3对NCC总蛋白水平的调节作用。3)转染前一天细胞分离传代,在2个10 cm培养皿接种Cos-7细胞,放置37℃细胞培养孵育箱内,24小时内观察细胞生长密度在30-40%时进行质粒DNA转染。Cos-7细胞单独转染GFP-NCC或同时转染HA-WNK3,使用anti-HA及壁珠收集WNK3蛋白,血清作为对照。洗脱后跑蛋白印迹检测NCC,观察WNK3对NCC蛋白有无直接调节作用。结果：1)免疫共聚焦显微镜可以观察到WNK3主要分布在Cos-7的细胞浆,而NCC分布在细胞浆和细胞膜,结果提示转染WNK3后,NCC在胞浆和包膜的表达量显著增强。2)WNK3、NCC转染Cos-7细胞,免疫印迹结果显示：随着WNK3剂量的增加,NCC的表达水平显著提高。3)Cos-7细胞单独转染GFP-NCC或同时转染HA-WNK3,抗HA抗体可以使HA-WNK3免疫沉淀NCC,但未转染HA-WNK3或血清作为一抗却没法使免疫沉淀NCC,提示WNK3和NCC可以直接相互作用。结论：WNK3主要分布在Cos-7的细胞浆,而NCC分布在细胞浆和细胞膜。WNK3高表达可增强Cos-7细胞NCC表达量。免疫沉淀实验提示两者有直接相互作用的可能性。第三部分WNK3对NCC蛋白合成和降解过程的影响目的：WNK3激酶是否通过影响NCC蛋白合成或降解途径而增加NCC表达量。方法：1)Cos-7细胞分2组,细胞贴壁生长丰度达到30-40%时分别转染NCC和NCC+WNK3,培养48小时后两组细胞均换成含有100ug/ml CHX(Cycloheximide from microbial)的培养液。在37℃细胞培养箱分别培养0、1、2、4、6、8小时收集并裂解细胞,配制样品蛋白。进行相关蛋白测定。2)Cos-7细胞分4组,向每组中转染恒定剂量的NCC(0.5μg/组),向第2、4中转染相同剂量的WNK3(1μgg/组)。转染16小时后,第3、4加入质子泵抑制剂Baf A1 (Baflomycine A1)阻断溶酶体降解通路,1、2组中加入等量的DMSO。Baf A1的使用终浓度均为0.5μmol/L。12小时后裂解细胞,配制样品蛋白检测NCC表达量的变化。结果：1)单独转染NCC的Cos-7细胞,NCC蛋白表达在CHX作用2小时后显著降低,而WNK3+NCC组在CHX作用6小时后.NCC才开始显著减少。2)在第1,2组中,相对单独转染NCC组(第1组),WNK3激酶显著增加了NCC蛋白表达(第2组),增加幅度达2倍(p<0.05,n=4)。含有0.5 μM Baf A1培养液预处理Cos-7细胞后,单独转染NCC组(第3组)相对未经Baf Al预处理的NCC组(第1组),NCC蛋白表达增加了50%(p<0.05,n=4)。但Baf A1预处理的WNK3+NCC组(第4组),较没有Baf A1预处理的WNK3+NCC组(第2组)NCC上升不显著,提示WNK3可能通过减少NCC溶酶体途径降解,从而增加NCC表达量。结论：WNK3激酶增加NCC蛋白表达可能通过减少NCC溶酶体降解途径调控NCC,而与蛋白合成途径无显著相关。第四部分ERK通路在WNK3调节NCC机制中的作用目的：WNK3增加NCC总蛋白表达水平是否通过MAPK ERK1/2细胞信号通路。方法：1)Cos-7细胞传代接种在6cm培养皿,分3组,每组均转染0.5 μg pCMV-HA-NCC,各组分别转染0、1、3ug pCMV-Myc-WNK3,培养36小时后收集细胞并裂解。使用anti-HA和anti Myc抗体、t-ERK和pERK抗体检测相关蛋白。2)Cos-7细胞分4组,第二组转染Scramble siRNA,第四组转染ERK 1/2 siRNA,第二、四组转染WNK3质粒,48小时后检测相关蛋白。用Microchemi化学发光成像系统显色条带,测量目的及内参的灰度值,取其比值作为结果进行分析。结果：1)随着WNK3剂量的增大,p-ERK1/2的表达水平也随之下降,表明WNK3以剂量依赖的方式抑制p-ERK1/2的表达。t-ERK1/2为p-ERK1/2的蛋白上样内参,表明ERK1/2的总量没有变化。2)过表达WNK3可以上显著增加Cos-7细胞的NCC表达量。与未转染WNK3组相比有统计学差异。沉默ERK 1/2表达本身可以增加NCC表达。但沉默ERK 1/2可抑制WNK3介导的NCC表达上调。结论：WNK3抑制p-ERK1/2蛋白的表达,且与WNK3呈剂量依赖关系,以上正反两个实验证实WNK3通过MAPK ERK1/2信号通路调节NCC的表达水平。第五部分WNK3激酶对白介素-1β诱导HEK293细胞凋亡的保护作用目的：观察WNK3高表达对白介素-1β诱导HEK293细胞凋亡有无保护作用。方法：1)转染前一天在6cm培养皿内传代HEK293细胞(共3组,每组3盘),细胞生长密度在40%时进行质粒DNA转染,第一组和第二组转染1μg PCMV-HA-Vector,第三组转染加入3μgWNK3,转染4h后换成正常培养液继续培养20h,细胞以1×104个细胞/每孔的密度接种于96孔板,第二、三组培养液中加入10ng/ml IL-1β(第二组为阳性对照)：第一组培养液加入等量生理盐水作为阴性对照。于37℃孵箱中孵育0h、12h、24h和36h时,使用CCK-8检测细胞活性。2)Cos-7细胞分3组,每组3盘,放置37℃细胞培养孵育箱内,24小时内观察细胞生长密度在40%时进行质粒DNA转染,转染步骤同上,转染4h后换成正常培养液继续培养20h,第二、第三组加入10ng/ml IL-1β,第一组加入等量生理盐水。于孵箱中孵育0h、18h、36h时收集细胞蛋白进行检测Caspase-3、Cleaved Caspase-3, Caspase-9、Cleaved Caspase-9, Bcl-2、Bax、LC3A/B、Beclin-1等凋亡和自噬相关蛋白等表达水平。3)分组及转染方法同上,但在IL-1β(对照组用等量生理盐水)干预Omin、30min、60min离心收集细胞,检测JNK、ERK等通路蛋白。结果：1)Vector+NS组在等量生理盐水干预0小时至48小时细胞活性变化不显著,无统计学差异。而Vector+IL-1β组在给药后细胞活性即开始逐渐下降,在24小时与同组0小时比较出现统计学差异(93.21±3.83VS 77.25±4.60,P<0.05),在48小时达到最低值(93.21±3.83 VS57.26±6.71,P<0.01),WNK3+IL-1β组下降幅度较缓和,在36小时和48小时与同组0小时比较出现统计学差异(均P<0.05),但与同时间点Vector+IL-1β组比较细胞活性有所回升,在48小时达到显著差异(57.26±6.71 VS 80.35±5.34,P<0.01)。2)而Vector+IL-1β组在给药后18小时Bcl-2表达量开始逐渐下降,在36小时与同组0小时比较出现统计学差异(P<0.05)；给药后18小时Caspase-9和Caspase-3表达量开始逐渐下降,Cleaved Caspase-9增加,在18小时到达高峰,36小时略有下降,同时在36小时检测到较为显著的Cleaved Caspase-3。WNK3+IL-1β组Caspase-3下降幅度较缓和,Caspase-9变化不显著,检测到微弱的Cleaved Caspase-9,但变化无统计学差异。在36小时才检测到少量CleavedCaspase-3,与同组0小时比较出现统计学差异(P<0.05)。WNK3+IL-1β组Bcl-2减少、Bax变化无统计学差异。IL-1p诱导细胞后,Beclin-1和LC3蛋白均有增加,WNK3高表达可通过Beclin-1途径部分逆转自噬蛋白的表达。3)IL-Iβ可同时促进激活JNK和ERK的磷酸化。WNK3转染后,p-JNK、pERK的表达水平较未转染3WNK3组的上升幅度降低。结论：1)IL-1p诱导HEK细胞活性下降,而转染WNK3可以有效部分逆转细胞活性。2)WNK3通过Beclin抑制其过度自噬,抑制Caspase途径的活化,减少细胞凋亡,起到在不利条件下保护肾脏细胞的作用。3)WNK3过表达可抑制白介素-1β诱发的JNK和ERK通路的激活与磷酸化。