研究背景骨缺损的有效解决办法--组织工程学在骨科领域,由于外伤、骨肿瘤、骨坏死等原因,导致不同程度的骨缺损,在临床上非常常见,由于植骨来源的限制,尤其是大段骨缺损,在治疗上仍然是一大难题。组织工程学的发展为骨缺损的治疗提供了一个新的突破点。而寻找增殖和分化能力强、来源充足的干细胞,具备较强地诱导并促进增殖和分化的成骨因子以及最佳的新支架材料,达到最佳的骨缺损修复效果是骨科领域不断深入研究的热点。骨的形成是由成骨干细胞、成骨的环境支架以及调节成骨的因子三个要素共同作用的结果。获取稳定的、可诱导分化成骨细胞的成骨前体细胞(种子细胞)至关重要。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)系的建立为人类探索干细胞生物学调控机理和评价其治疗许多疾病的潜能打开了方便之门,但胚胎干细胞的研究面临许多社会伦理问题。目前研究较多的是骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs),曾被认为是骨组织工程中最佳的细胞来源。然而,在临床应用过程中,自体骨髓干细胞治疗需要从患者身上获得大量的细胞,这是一个侵害性的过程,且一次最多可抽取到40ml的骨髓,约1.2×109个有核细胞,量偏少,使其应用受到了很大限制。脂肪干细胞(adipose-derived stem ells,ADSCs)近年来研究证实,在脂肪组织中能分离和培养出脂肪间充质干细胞(ADSCs),与MSCs类似,来源于发育早期的中胚层和外胚层,可以向成软骨细胞、成骨细胞、神经细胞和脂肪细胞等不同胚层来源的细胞分化,具备自我更新能力与多向分化潜能,兼有骨髓间充质干细胞等特性。局麻条件下,通过真空抽脂术,成人一次可获取200ml的脂肪组织,获得约1×106个ADSCs,约是40ml骨髓中BMSCs的40倍。ADSCs由于取材容易,创伤小,含量高,增值能力好,无免疫排斥反应等优势,且可来自自体细胞,不存在伦理学的争议,是一种较理想的组织工程种子细胞。有研究表明,ADSCs体外条件下容易导入外源基因,可作为基因治疗的目的基因载体。骨形态发生蛋白9(Bone morphogenetic protein-9,BMP-9骨形态发生蛋白(BMPs)是转化生长因子beta超家族(Transforming growth factor-beta, TGF-P)的成员之一,结构类似且高度保守,能够有效诱导体内和体外实验中成骨分化。Kang等的研究证实BMP9是体内外诱导MSCs成骨分化功能最强的成员之一其诱导成骨作用强于传统应用的BMP2、6、7,是一种重要的成骨细胞分化调节因子。该研究结果为促进间充质干细胞成骨分化,构建具有基因强化成骨活性的组织工程骨找到了有显著意义的突破点。淫羊藿苷(Icariin, ICA)近年来,我国研究发现传统中药成分淫羊藿苷对摘除卵巢所致大鼠骨质疏松症有良好的防治作用,而且能够促进体外培养的BMSCs的增殖及成骨分化。且淫羊藿苷提取工艺简单,来源广泛,费用较低,对促进骨缺损修复是一种很有应用前景的中药单体。近年来的研究成果肯定了淫羊藿能够诱导间充质干细胞成骨分化,可用于骨组织工程中促进骨缺损的修复。载体支架材料—纳米晶胶原基人工骨(Nano-hydroxyapatite/collagen, nHAC)目前国内外人工骨修复支架材料的研究热点是模仿天然骨的成分结构特性及矿化过程,研制仿生人工骨修复材料。纳米晶胶原基骨(nHAC)是清华大学材料系根据仿生原理制备而成的纳米骨复合材料。2005年4月获得批准上市,成为国内首个可以在市场上公开销售和应用的纳米医药产品。在微结构和成分两方面都与天然骨有相似性,材料的孔隙结构与松质骨相同,分级结构与天然骨相同,是良好的细胞载体,能够为细胞的生长、增殖分化提供良好的微环境。nHAC骨修复材料已经在动物实验、临床上修复骨缺损方面有良好的表现。基于上述,本项目开展了以下研究：①将BMP-9基因转染脂肪干细胞,使组织局部持续表达BMP-9；②复合淫羊藿苷与nHAC组装成三维缓释支架,使修复局部持续缓释细胞的诱导和营养物质--淫羊藿苷；③并将此缓释支架作为自体脂肪干细胞(ASCs)的载体,然后将制成的细胞支架复合体(转染了BMP-9的ADSCs+携淫羊藿苷的nHAC支架复合体)置于体内,治疗兔大段桡骨缺损。研究包括体外、体内两方面实验,分别在细胞和动物水平上进行。观察BMP-9及淫羊藿苷诱导ADSCs的成骨效能。为治疗骨缺损进一步研究提供理论和实验依据。目的1.建立一种简单高效的兔脂肪干细胞的体外分离、培养、传代方法,证实其多向、尤其是骨向分化潜能。2.载hBMP-9的腺病毒(Ad-hBMP-9)转染脂肪干细胞,为ADSCs持续、高效、稳定表达BMP-9及后续的体内成骨实验提供基础。3.进一步探讨ADSCs体内成骨的效率：BMP-9修饰的同种异体脂肪干细胞复合携淫羊藿苷支架材料(nHAC)修复兔大段桡骨缺损。方法1. ADSCs的分离、培养及鉴定：新西兰大白兔麻醉后在无菌条件下分离兔腹股沟皮下脂肪组织,剪碎成脂肪颗粒后采用0.1%I型胶原酶37℃恒温条件下震荡消化,用含10%胎牛血清(F B S)及1%双抗(青霉素、链霉素)的高糖基础培养基(DMEM)在细胞培养箱中进行贴壁培养、扩增、纯化和传代兔ADSCs,并对其细胞的形态、体外增殖能力进行观察统计,绘制细胞生长曲线,并对其经过诱导,对其成骨、成脂肪、成软骨能力的分化及表面标记抗原的表达进行分析鉴定研究。2.以腺病毒为载体,Ad-hBMP-9转染脂肪干细胞的实验：载BMP-9的腺病毒直接感染P3代的ADSCS。相差显微镜及荧光显微镜下观察转染效果、细胞的生长形态；MTT法检测Ad-hBMP-9转染ADSCs增殖情况,绘制ADSCs生长曲线；RT-PCR检测目的基因BMP-9 mRNA的表达；碱性磷酸酶染色检测ADSCs的成骨情况。3.建立兔桡骨15mm缺损模型,实验分成7组,每组各8只,共56只。按照分组：A组：ADSCs+支架+BMP-9+淫羊藿苷；B组：ADSCs+支架+BMP-9;C组：ADSCs+支架+淫羊藿苷；D组：ADSCs+支架；E组：支架+淫羊藿苷；F组：支架；G组：空白对照(注：BMP-9是转染至ADSCs内持续表达起作用的)。分别于术后30天、60天、90天、109天在兔麻醉下行实验桡骨的X线检测、并根据Lane-Sandhu X线评分法进行x线片评分。于术后第60天、109天分两批处死实验兔,取出桡骨行缺损处骨修复情况的大体观察、生物力学测定以及组织学观察、并利用计算机图像分析系统对组织学切片行半定量检测分析分析骨缺损处成骨面积比例,探讨体内成骨的效率。结果1. ADSCs的分离、培养、分化及鉴定：通过胶原酶消化+贴壁培养法,体外成功地从脂肪组织中分离、培养出大量的成纤维细胞样外观的兔脂肪干细胞(ADSCs),具有良好的细胞形态(呈梭形或多角状,类似成纤维细胞,团簇状生长)和极强的增殖能力。经体外培养、诱导分化,ADSCs具有成骨、成软骨及成脂分化潜能。兔第三代ADSCs表面标记CD34、CD105阳性,Sca-1高表达,不表达CD45及SSEA-1,具有干细胞的表面分子的特征。2.BMP-9转染ADSCs的实验：(1)载BMP-9基因的腺病毒可成功转染ADSCs.(2)荧光显微镜观察,病毒感染的ADSCs,细胞核和细胞质都显示绿色荧光,各细胞荧光强弱不等。转染后24 h已经有较多量的绿色荧光出现。根据转染后24小时的EGFP表达率统计Ad-hBMP9转染ADSCs的转染效率为30.6士4.2%。48～72 h,荧光明显增多、增强。7d后,转染率高达80%以上,细胞呈团聚状生长,细胞体积增大,部分细胞形态呈椭圆形。未感染病毒的ADSCs荧光显微镜下无绿色荧光出现。(3)Ad-hBMP9转染ADSCs后的生长曲线与正常培养的ADSCs的生长曲线基本一致。(4)RT-PCR检测结果显示,各转染组细胞内hBMP-9的mRNA持续阳性表达,未转染组未见阳性条带。(5)ADSCs转染后,ALP染色为阳性,转染Ad-hBMP9后第7d,ALP染色显示黑色细胞数目多,细胞胞浆内有黑色颗粒,颗粒较大,染色更深。未转染组：细胞内偶见少量黑色颗粒,染色较淡。3.动物体内实验：(1)X线检查：A组：术后30天植入区有骨痂形成；60天骨痂与断端宿主骨间界限模糊,骨痂密度不均匀,皮质骨轮廓出现,骨缺损已基本消失,有典型的骨愈合影像；90天骨痂已经塑形,新生骨皮质结构清晰,与断端骨自然连接,髓腔基本再通,109天髓腔完全再通。支架材料已经基本降解。B组：60天缺损区有少量骨痂生成,骨缺损处可见有云雾状高密度影,缺损区依然存在。109天骨痂已经塑形,与断端骨自然连接,髓腔基本再通,支架材料大部降解。C组：109天骨缺损区表现为较多骨痂生成影像,断端连接,但仍然有缺损,髓腔未通,支架材料基本降解。D组、E组：90天缺损区有少量骨痂生成,骨缺损处可见有云雾状高密度影,缺损区依然存在。109天骨痂有所增多,骨断端连续性仍未建立。F组：109天缺损区有少量骨痂生成,少量云雾状高密度影,支架材料大部已经降解。G组：109天骨断端已完全硬化,桡骨断端间无任何连接,呈现骨不连表现。此外,骨缺损愈合的Lane-Sandhu X线评分显示,A组评分显著高于其他组,B、C两组也明显好于D、E、F、G组(P<0.05)。(2)组织学检查：术后第60天A组骨缺损处可见在支架材料的孔内有较多小梁骨形成,新生小梁骨内可见骨细胞散在分布于骨基质中。而小梁骨的周围有正在形成的新生骨组织,可见到骨陷窝散在其中,并观察到正在降解的团块状的支架材料。B组的骨缺损处可见在支架材料的大部分微孔内有小梁骨形成,骨细胞散在分布于新生小梁骨内的骨基质中。术后109天,A组于骨缺损处大量生成小梁骨,小梁骨之间有骨髓样组织,形成髓腔,髓腔通畅。B组见较多小梁骨形成,其周边可见大量正形成的新生的骨组织,髓腔部分通畅。在术后60天、109天,C组骨缺损处理也见新生骨组织形成。D、E、F组则有少量新骨增生、散在类骨质形成。在整个观察期间,G组未见有任何成骨现象、断端封闭。此外,组织学切片半定量检测结果分析各实验组骨缺损处成骨面积比例：术后第60天、109天A组成骨面积比例均显著高于其他组,B、C组优于D、E、F组。其余组对G组(空白对照组)均有显著性差异。(P<0.05,n=4)(3)生物力学测定：术后第109天取出的实验桡骨(n=4)行生物力学测定结果显示：A组的抗折断力显著高于其他组,B、C两组也明显好于D、E、F、G组(P<0.05)。结论1.通过胶原酶消化+贴壁培养法,体外成功地从脂肪组织中分离、培养出大量的成纤维细胞样外观的兔脂肪干细胞(ADSCs)。体外培养的兔ADSCs具有纯度高,形态均匀,稳定性较好,易于增殖扩增等特点。2.本实验分离、培养的兔ADSCs具有干细胞的表面分子的特征。3.实验证实,重组腺病毒介导的hBMP-9基因体外转染脂肪干细胞具有较安全、转染效率高的特点,转染Ad-hBMP-9的脂肪干细胞能有效表达BMP-9 mRNA。重组腺病毒是一种理想的基因载体。4.转染Ad-hBMP-9后,ADSCs能够成功地持续表达BMP-9。5. Ad-hBMP-9转染脂肪干细胞后,细胞依然保持较旺盛的增殖能力,且细胞转化为具有成骨能力的细胞。被转染后的hBMP-9基因成功地诱导了ADSCs向成骨细胞分化。6.本研究证实,将BMP-9转染的ADSCs复合携淫羊藿苷的nHAC支架材料植入兔桡骨15mm节段性骨缺损中,于术后第30天、60天、90天、109天影像学检查,术后第90天、109天的组织学、生物力学等证实骨缺损完成修复,构建的这种组织工程骨有效促进了骨再生,提高了骨缺损的修复效果,为骨组织工程种子细胞的选择以及组织工程骨复合体的构建、设计提供了一种新的思路。