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目的:本研究运用Real time PCR(实时定量PCR)技术,观察IGF-1(胰岛素生长因子—1)mRNA在糖尿病大鼠膀胱的表达变化。进一步说明IGF-1的表达变化在糖尿病性膀胱病发生发展中的作用。糖尿病性膀胱病(diabetic cystopathy ,DCP)是一种糖尿病泌尿系统的并发症,主要是由糖尿病周围神经病变引起的膀胱功能障碍,其发病与年龄、性别无关。并且其起病隐匿,早期无明显症状,出现症状时已经是晚期,早期诊断比较困难。其临床特点是排尿量和排尿次数的改变、排尿困难、尿失禁、膀胱容量增大、出现残余尿以及泌尿系的感染。对于糖尿病性膀胱病目前尚无特效地治疗方法,治疗仍然是以治疗糖尿病为主,并辅以其他治疗措施。这种治疗方法对于早期糖尿病性膀胱病可以延缓病程的进展,但是对于晚期患者这种方法无法有效地逆转膀胱症状。导致晚期患者的生活质量较差。因此,糖尿病性膀胱病的早期诊断、治疗和病因的研究已成为相关学科研究人员关注的重点。近年来,随着分子生物学、细胞生物学、细胞生理学和神经生物、生理学的发展进步,特别是在神经创伤修复与神经退行性疾病预防和治疗方面的深入研究,对一些与神经分化发育及再生修复密切相关的生物活性物质,如胰岛素生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF),进行了广泛而深入的研究,在理论以及应用方面都取得了长足的进展。目前研究发现胰岛素样生长—Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ,IGF-1)是一种具有多种生物学功能的细胞因子,可促进细胞分化,增殖,抑制凋亡。尤其IGF-1对神经细胞、成骨细胞等的增殖分化起关键调节作用,有助于神经细胞受损后的功能恢复,现在已被证实对神经系统起重要的营养保护作用。在糖尿病性膀胱病方面,目前国内外都将焦点放在了NGF和糖尿病性膀胱病的关系上,目前关于IGF-1与糖尿病性膀胱病的关系的研究较少,尚处于起步阶段。而Real time PCR(实时定量PCR)技术在检测IGF-1因子上有先天的优势。和其他实验方法相比,不仅操作简单,而且更加客观、准确。这种方法对RNA的质量要求还很低,可以检测到极低浓度的mRNA。本研究可为今后糖尿病性膀胱病的研究与治疗提供实验依据,为糖尿病性膀胱病的研究与治疗提供新的、有效的途径。方法:1实验动物及分组:所用动物为30只Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠,由河北医科大学实验动物中心提供,体重200～250g。随机分成3组,正常对照组10只,糖尿病组10只,治疗组10只。SD大鼠禁食12h以上,糖尿病组、治疗组大鼠按60mg/kg腹腔注射STZ。对照组腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液。注射STZ 72小时后测空腹尾静脉血葡萄糖浓度(blood glucose,BG)。BG>16.7mmol/L为造模成功。将造模成功的大鼠按血糖高低随机分为糖尿病组、治疗组。治疗组SD大鼠在造模成功后第二天,给予皮下注射精蛋白锌胰岛素,使BG维持在3.9～10mmol/L。正常对照组、糖尿病组大鼠同时给予皮下注射相同容积的生理盐水。三组均于造模成功后8周后进行实验。2实时定量PCR:RNA提取采用的是天根生化科技北京有限公司的TRNzol Reagent,按说明书操作。cDNA第一链的合成采用的是天根生化科技北京有限公司的Quant cDNA第一链合成试剂盒,按说明书操作。内参基因采用的是β-actin,引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。荧光定量PCR采用的是20ul反应体系,包括:2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution 9ul,cDNA 2ul,10umol/ul的引物各0.5ul,超纯水8ul。反应在ABI7500荧光定量PCR仪中进行。反应条件为:95℃起始模板变性2分钟,1个循环,95℃PCR循环中模板变性20秒,60℃退火30秒,68℃延伸50秒,40个循环,68℃时检测荧光。分析软件通过样本中的荧光强度得到IGF-1、β-actin的Ct值。3统计学分析:根据IGF-1、β-actin的Ct值,运用2-△△Ct方法计算,以△Ct = Ct IGF-1(目的基因)– Ctβ-actin (内参照基因)表示基因的相对拷贝数,△Ct值越低,实际拷贝数越高,基因表达量越高。IGF-1、β-actin的基因表达量以均数±标准差方法表示(—x—±s)单因素方差分析进行统计,以P < 0.05具有统计学意,用SPSS18.0件包完成。结果:大鼠膀胱组织IGF-1 mRNA表达变化:正常对照组、糖尿病组、治疗组大鼠膀胱组织总RNA经Real time PCR(实时定量PCR)后,△Ct值见图表(Table.1)。IGF-1 mRNA在糖尿病组的表达量为6.141±0.916,在正常对照组的表达量为4.018±0.491,在治疗组的表达量为4.922±0.788。对数据进行统计学分析(Table.2),可见IGF-1 mRNA在糖尿病组表达量明显下调(p<0.05)。经胰岛素治疗后可上调IGF-1 mRNA的表达量(p<0.05,Fig.1)。结论:本实验通过运用Real-time PCR(实时定量PCR)技术研究IGF-1 mRNA在糖尿病大鼠膀胱的表达变化,得出以下结论:1 IGF-1mRNA在糖尿病大鼠膀胱中表达明显下调,参与了糖尿病性膀胱病的病变的发生和发展。2治疗组中,胰岛素可以逆转IGF-1 mRNA在糖尿病大鼠膀胱中的表达,提示IGF-1mRNA下调和链脲佐菌素的毒性无直接关系,与胰岛破坏无直接关系。