目的玉竹(Polygonatum Odoratum (Mill.) Druce)是百合科黄精属中草药,药用根茎中含有多糖、黄酮、生物碱、甾体皂苷、甾醇、鞣质、黏液质和强心苷等多类成分。现代药效学研究证明玉竹有抑制免疫功能、抗肿瘤、抗凝血、抗衰老和降血糖等作用。玉竹提取物A是一种醇水提取物,经研究发现其具有抑制细胞免疫功能和炎症反应的特点,前期试验已经证明一定浓度的玉竹提取物A可以抑制炎症细胞释放IL-1和TNF-a等促炎症细胞因子,鉴于玉竹提取物A具有低毒和安全的特点,进一步研究其在抗炎方面的作用和机制是非常必要的。一氧化氮(Nitric oxide, NO)参与炎症及免疫反应等过程,在病理情况下合成的大量NO会引起急、慢性炎症反应。内源性的NO是由一氧化氮合成酶州Osynthase, NOS)氧化L-精氨酸(L-Arg)产生的。NOS有三种同功酶即内皮型(endothelial NOS, eNOS或NOS-Ⅲ)、神经型(neuronal NOS, nNOS或NOS-Ⅰ)和诱生型(inducible NOS, iNOS或NOS-Ⅱ)。iNOS只在炎症细胞受到刺激被激活后才表达,尤其是巨噬细胞。iNOS主要存在于细胞质中,诱导iNOS的刺激物包括血红素、脂多糖、细胞因子IFN-γ、TNF-a和IL-1α等。许多实验已经证实,体内iNOS被激活后,释放出的大量NO与多种病理改变相关,包括组织损伤和多种炎症疾病、神经疾病和自身免疫性疾病等。因此,选择性的抑制iNOS进而抑制过量NO产生,将对以上疾病的治疗具有一定的应用前景。iNOS抑制剂具有阻断炎症信息传递通道的作用,有效地抑制iNOS不仅能在初始阶段影响炎症的发生,也对抑制和终结炎症有作用。前期实验已经证实,玉竹提取物A在一定程度上能抑制由LPS诱导的巨噬细胞分泌促炎症细胞因子(如IL-1和TNF-α),达到抑制炎症反应的作用。本实验旨在进一步证实这一结果,同时研究玉竹提取物A能否对炎症损伤中占有重要作用的炎症介质NO同样起到抑制作用,并且进一步揭示其内在机制。研究玉竹提取物A对LPS诱导巨噬细胞产生的炎性介质——NO、IL-6和TNF-α的影响的同时,也检测玉竹提取物A对iNOS表达的影响。从而进一步验证玉竹提取物A对小鼠巨噬细胞免疫功能的调节作用。实验方法取清洁级6—8周龄雌性BALB／c小鼠4只,无菌条件下取小鼠腹腔细胞,于37℃5%C02条件下培养1 h,去除未贴壁细胞,贴壁的巨噬细胞经胰酶消化,收集、离心和清洗后计数细胞数,调整细胞密度为2×106／ml。台盼蓝染色,细胞活力>99%,即为提纯的腹腔巨噬细胞,备用。将提纯的腹腔巨噬细胞以2×106／ml的密度加入96孔培养板中,实验分组包括空白对照组(巨噬细胞+培养基)和玉竹提取物A各浓度实验组(15.625-1000μg／ml玉竹提取物A+巨噬细胞+培养基),各孔终体积均为200μl,细胞终密度是1×106／ml,一式5复孔。在上述培养条件下培养24h,MTT法检测巨噬细胞存活率。将上述提纯的腹腔巨噬细胞以同样密度分别加入两块96孔培养板中,采取同样分组,空白对照组(巨噬细胞+培养基)、LPS对照组(LPS+巨噬细胞+培养基)和玉竹提取物A各浓度实验组(250-1000gg／ml玉竹提取物A+LPS+巨噬细胞+培养基)。其中一块板在37℃5%C02培养条件下培养6h,采用ELISA法检测上清中IL-6和TNF-α的水平；其中另一块板在相同培养条件下培养24h,Griess法检测上清中NO的水平。同时用Western blotting法检测细胞中iNOS表达情况。实验数据以均值±标准差((?)±s)表示,经f检验处理,p<0.05为差异显著。实验结果经MTT法检测发现,玉竹提取物A在15.625-1000μg／ml浓度范围内对小鼠腹腔巨噬细胞的活力无明显影响,没有直接的细胞毒作用。通过ELISA检测,结果证明玉竹提取物A在500-1000μg／ml的剂量范围内具有明显抑制LPS活化的小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α的作用(p<0.05),并具有一定剂量依赖性。经Griess法检测,结果证实玉竹提取物A在250-1000μg／ml的剂量范围内可明显抑制活化小鼠腹腔巨噬细胞释放NO(p<0.05),也呈现一定的剂量依赖关系。通过Western blotting法检测,结果表明1000μg／ml玉竹提取物A能够在一定程度上抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO,是通过下调iNOS的表达而达到的。讨论本实验研究了玉竹提取物A对活化小鼠腹腔巨噬细胞增殖抑制的作用,证明玉竹提取物A在15.625-1000μg／ml浓度范围内对小鼠腹腔巨噬细胞的活力无明显影响。通过检测玉竹提取物A对活化小鼠腹腔巨噬细胞分泌促炎症细胞因子的抑制作用,得出在500-1000μg／ml的剂量范围内玉竹提取物A具有明显抑制IL-6和TNF-α这些促炎症细胞因子的作用,同时,也具有一定剂量依赖性。研究玉竹提取物A对小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的抑制作用证实玉竹提取物A在250-1000μg／ml的剂量范围内可明显抑制活化小鼠腹腔巨噬细胞释放NO(p<0.05),并呈现一定的剂量依赖关系。通过Western blotting法检测玉竹提取物A对iNOS表达的影响。结果表明高浓度玉竹提取物A能够一定程度上抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO,是通过下调iNOS的表达而达到的。巨噬细胞具有非特异性吞噬和抗原提呈的功能,在非特异性和特异性免疫应答过程中发挥重要的作用。巨噬细胞免疫应答是机体发挥防御机制的基础,当细菌侵入机体繁殖和被杀灭时,有大量的内毒素释放到体液中,刺激巨噬细胞的活化并释放过量的炎症因子,如NO、TNF-α、IL-6等,从而造成瀑布式的炎症失控性反应,使组织损伤并成为炎症。活化的巨噬细胞通过iNOS途径产生大量的NO,iNOS是NO产生的三种重要酶类之一。通过对iNOS的调控,从而控制活化巨噬细胞对NO的释放,以至于调控免疫功能。以上结果提示玉竹提取物A很有可能是一种新型有效的抗炎药物的候选者,从中草药中筛选出新的低毒安全的抗炎药物可能是一条有效的途径。由于传统的非甾体类抗炎药物被报导称有包括增加心血管风险等在内的较多副作用,因此,新型安全的抑制炎症药物的研究与开发势在必行。已有研究表明,玉竹提取物A是一种低毒安全的中药提取物(其半数致死率LD50用寇氏法计算为14.5124 g／kg)。研究玉竹提取物A在炎症及免疫疾病中的应用价值,为临床应用玉竹提取物A治疗炎症疾病和中药玉竹的进一步开发利用提供了理论依据。结论1、玉竹提取物A在15.625-1000μg／ml浓度范围内对小鼠腹腔巨噬细胞的活力无明显影响。2、玉竹提取物A能有效抑制LPS活化的小鼠腹腔巨噬细胞释放促炎症细胞因子IL-6和TNF-a,并呈现一定的剂量依赖关系。3、玉竹提取物A能够抑制LPS活化的小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO,是通过下调iNOS的表达而达到的。