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猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床症状的高度接触性肠道传染病,主要感染2周龄内的仔猪,其致死率可达100%,是世界各养猪国家仔猪早期死亡和生长发育迟缓的重要疫病。近年来,TGE的流行进一步加剧,给养猪业造成了严重的经济损失。虽然有疫苗用于预防,但由于对病毒的致病机理尚未阐明,一直没能从根本上控制该病。猪传染性胃肠炎病毒主要经消化道感染小肠,在小肠上皮细胞内大量复制,可破坏上皮细胞钠离子转运功能,导致肠道渗透压升高,引起腹泻。已知膜转运蛋白NHE3(Na~+/H~+exchanger 3)主要介导肠细胞Na~+/H~+交换,并且与腹泻的发生发展密切相关。生理状态下,Na~+-葡萄糖转运体SGLT1介导的NHE3易位可参与调控NHE3的活性,但在TGEV感染条件下,能否通过改变NHE3的易位,进而影响NHE3的活性?该疑问还不清楚。鉴于此,本试验以小肠上皮细胞IPEC-J2为感染模型,分别通过构建慢病毒干扰载体和利用抑制剂根皮苷Phlorizin抑制SGLT1的表达,探讨TGEV感染对NHE3易位的影响与分子机制,为揭示TGEV致病机理提供新的理论依据。主要研究内容如下:1.TGEV感染IPEC-J2后对SGLT1和NHE3的表达及钠氢交换活性的影响以IPEC-J2为感染模型,感染TGEV后。利用蛋白免疫印迹Western-blot和实时荧光定量RT-qPCR方法分别检测SGLT1和NHE3的蛋白表量变化和相对mRNA水平;生物素化法检测细胞膜上NHE3的蛋白表达量变化;利用pH荧光探针BCECF-AM检测NHE3的活性变化。结果发现:TGEV感染后会引起SGLT1的蛋白表达量上调和mRNA水平升高;NHE3的总蛋白表达量没有显著性变化,而质膜上NHE3的蛋白表达量下调;NHE3的活性随着感染时间增加而逐渐减弱。结果提示TGEV感染可下调质膜上NHE3的表达量,进而使得NHE3的活性下降。2.生理条件下,SGLT1调控NHE3易位的机制研究(1)根据NCBI中GenBank(NM-001012297)已注册的SGLT1 CDS区序列,分别设计4条siRNA序列,然后构建慢病毒干扰载体piLenti-siRNA-GFP,并感染IPEC-J2细胞测定慢病毒最适感染复数MOI,同时进行抗性药物嘌呤霉素puromycin浓度的摸索以筛选稳定表达干扰细胞株;Western-blot和RT-qPCR法筛选最佳干扰片段;Western-blot法检测干扰SGLT1表达后p-38MAPK/AKt2信号通路中关键蛋白MAPKAPK-2和EZRIN的磷酸化表达情况;生物素化法检测细胞膜上NHE3的蛋白表达变化;火焰原子吸收法检测细胞内外Na~+的浓度。结果表明,慢病毒的最适感染复数MOI为5,且puromycin的最适药物浓度为0.8μg/mL;RT-qPCR和Western-blot结果显示干扰效率最高的片段为piLenti-siRNAb-GFP,其抑制率均可达到60%以上;沉默SGLT1后下游信号通路中MAPKAPK-2和EZRIN磷酸化水平均上调,细胞质膜上NHE3的表达量也显著上调。以上结果提示下调SGLT1可促进NHE3的易位。(2)MTT法检测表明根皮苷抑制剂Phlorizin的最适细胞药物浓度为200μM;通过Western-blot和生物素法检测抑制SGLT1表达后p-38MAPK/AKt2信号通路中关键蛋白MAPKAPK-2和EZRIN的磷酸化水平以及细胞膜上NHE3的表达情况;利用pH荧光探针法检测抑制SGLT1后NHE3的活性变化。结果表明,显著抑制SGLT1的蛋白表达后MAPKAPK-2和EZRIN磷酸化水平均上调,细胞质膜上NHE3的表达量也显著上调,NHE3的活性显著增加。表明抑制SGLT1的表达后可促进NHE3的易位及增强NHE3的交换活性。3.TGEV感染条件下,通过SGLT1介导的p-38MAPK/AKt2信号通路调控NHE3易位的研究分别利用慢病毒干扰载体和抑制剂根皮苷Phlorizin下调SGLT1的表达后,再接种TGEV。通过Western-blot检测关键蛋白p-MAPKAPK-2和p-EZRIN的表达变化和生物素化法测定细胞膜上NHE3的表达量情况;利用火焰原子吸收法检测干扰SGLT1表达并接种TGEV后细胞内外Na~+的浓度变化;pH荧光探针法检测抑制SGLT1后接种TGEV后NHE3的活性变化。结果表明,沉默SGLT1表达后再接种TGEV发现,干扰接毒组信号通路中的MAPKAPK-2和EZRIN的磷酸化水平均显著上调,而药物抑制接毒组的MAPKAPK-2磷酸化水平无统计学变化,但EZRIN的磷酸化水平显著上调,细胞膜上的NHE3蛋白表达量均显著上调;火焰原子吸收法分析结果表明,干扰接毒组与接毒组相比细胞内的Na~+浓度显著增加,胞外显著减少;药物抑制接毒组和接毒组相比NHE3的活性显著增加。这些结果表明在TGEV感染条件下,抑制SGLT1可促进NHE3的易位从而加强对Na~+的吸收,提示SGLT1参与调控NHE3易位和钠氢活性,其对揭示TGEV的致病机制奠定了新的理论基础。