为了深入研究NDV的结构和功能、构建NDV感染性克隆，本论文对中国标准强毒F48E9株的全基因组cDNA进行了分段克隆，并测定了全基因组核苷酸序列。然后根据基因组的核苷酸序列，将其亚克隆到低拷贝表达载体pX8dT上，并使之位于T7 RNA聚合酶启动子和自催化的丁型肝炎病毒核酶之间，从而为将来获得感染性cDNA奠定了物质基础。 本实验首先参照国外已发表的NDV La Sota序列和已有的F48E9基因片段序列，应用Oligo(6.0)分析软件设计并合成了8对引物(F1、F2、F3、F4、F5、F6、3’、5’)和2条用于扩增5’和3’端的反转录引物(3’RT和5’RT)，利用RT-PCR方法分别扩增F48E9株NP、P、M、F+HN、L基因及3’端和5’端cDNA，并将其克隆到pMD18-T载体上；经限制性内切酶分析、质粒PCR鉴定以及序列测定，证明我们获得了含有新城疫病毒F48E9株全长基因组分段克隆阳性重组子p3、pM1、pM2、pM3、pM4、pLA、pLB和p5。然后对阳性重组子进行核苷酸序列测定，根据测得的序列设计并合成11条引物，利用PCR和限制性内切酶的方法将F48E9株全基因组分段的阳性重组子从克隆载体上亚克隆下来，并按顺序依次连接到低拷贝表达载体pX8dT上，采用Sanger’s双脱氧末端终止法进行测序，并应用DNASIS(Ver2.6)和DNASTAR分析软件将测序结果与新城疫病毒La Sota、Clone30、ZJ1、V4(HB92)和B1株的全基因组序列进行比较分析。 实验结果表明：F48E9全基因组具有15192个碱基，比La Sota、V4、B1和Clone30的全基因组序列长6个碱基，和鹅源ZJ1株的长度相等。序列比较发现F48E9株在相应于La Sota基因组的1647—1648(NP-P基因间隔区)的位置处有6个碱基的插入。为了验证该6个碱基是否只存在于强毒株及其与毒力的关系，我们又设计一对引物X1和X2。通过RT-PCR方法扩增获得了另外10个背景清楚毒株的NP-P基因间隔区片段，将这些序列与F48E9、La Sota、Clone30、B1、ZJ1和V4的相应序列进行了比较，结果在参比的16个NDV毒株中在该区段中除了有多个点突变外，个别毒株有碱基插入和缺失，所有以La Sota株为代表的弱毒株均无6碱基的插入，而以F48E9株为首的强毒株均有此6碱基的插入，但有一个中等毒力的毒株DP没有6碱基的插入，不过它的基因序列和La Sota的几乎相同，对于所克隆到的基因的代表性还有待确定。因此6碱基插入与新城疫病毒的毒力相关，但最后的确定还有待于做更深入的研究，至于是否与病毒的其它生物学特性有关还要做进一步的研究。值得注意的是：通过序列比较我们发现我国标准强毒F48E9株基因组cDNA5’端1705-1722bp处有一个5’TCTCTCTCCTCTCTCCTCC3’的一个特殊序列，现在还无证据说明它与病毒之间的关系及其功能。 此外，F48E9株L基因除了编码一个含有2204个氨基酸多肽外，还可编码一个52个氨基酸的疏水多肽，而NDV鸡源V4(HB92)株和鹅源分离株ZJ1的L基因不编码这个小蛋白。 东北农业大学农学硕士学位论文一 对六株NDV分离株全长基因组核音酸同源性进行比较发现，F48E9株与 La Sota、Clone30、ZJI、V4和BI的核昔酸同源性分别为：87．3％、87．7％、85．4％、88．8％和87．3％。这说明除了裂解位点以外NDV强弱毒之间仍存在着较大的差异，其中可能存在许多我们尚不知晓的重要结构，因此仅依赖中等毒力、弱毒株和无毒株的感染性克隆来研究NDV分子生物学特性、病毒的复制、致病机理、以及病毒和宿主之间的相互作用是远远不够的，构建强毒株的感染性分子克隆才是阐明NW致病机理更为有利的工具。 本研究成功地获得了 NDV F48E9 ＄t＄因组的核昔酸序列，并构建了表达NDV F48E9基因组CDNA的低拷贝表达载体休－F48E9，为构建新城疫病毒强毒株F48E9株的感染性CDNA奠定了物质基础，进一步研究NDV的生物学特性、结构与功能的关系；进一步探讨影响NDV毒力的因素、以及研制新型疫苗载体提供了可靠保证。