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脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),又被称作内毒素,是革兰氏阴性细菌细胞外膜的组成成分。能够增强吞噬细胞的吞噬活性,并促进炎性细胞因子大量的释放。炎症因子的释放对局部炎症反应是重要的,但是过剩的炎症因子将会导致感染性休克,常导致死亡。抗菌肽作为先天免疫系统的重要组成部分,具有分子量小,疏水性好等特征,具有中和LPS诱导内毒素作用的潜在能力。抗菌肽L-K6,L-K5,L-K6V1和L-K6V2是中国林蛙皮肤分泌物中得到的天然抗菌肽Temporin-1CEb的衍生肽,分别带6-7个净正电荷。前期实验已证明,四种抗菌肽具有良好的杀菌活性且能够与LPS相互作用,能够显著抑制LPS诱导细胞因子TNF-α、IL-8、NO的释放,抑制炎症反应。本论文以人单核巨噬细胞U937为实验对象,研究四种抗菌肽的抗炎机制以及其主要作用靶点。实验结果显示四种抗菌肽能够抑制LPS诱导产生趋化因子MCP-1、MIP-1的释放,能降低炎症因子TNF-α、IL-6和趋化因子MCP-1、MIP-1、IL-8基因的表达,其中抑制效果最好的是抗菌肽L-K6,其次是L-K5,相对其他三种肽抑制效果较弱的是L-K6V1。通过Western Blot方法,发现四种抗菌肽能够降低信号通路蛋白IκB、NF-κB、My D88、ERK、p38和JNK磷酸化水平,进而抑制LPS诱导的炎症反应。其中对My D88、IκB、ERK、p38和JNK磷酸化水平抑制效果最为显著的是抗菌肽L-K6。对NF-κB磷酸化水平抑制效果最好的是抗菌肽L-K5。L-K6V2的抑制效果相对较弱。激光共聚焦扫描显微镜观察到四种抗菌肽均能够在30min内进入到U937细胞内。细胞膜电位检测的结果显示四种抗菌肽进入细胞并没有引起U937细胞膜电位的变化,说明四种抗菌肽不会影响U937细胞膜的通透性。4℃时,四种抗菌肽进入细胞的数量与37℃培养条件下相比明显减少,说明抗菌肽是以能量依赖的形式进入细胞内部。有趣的是,LPS预处理U937细胞1小时后,发现四种抗菌肽进入细胞的量均有所减少,约减少20%左右。用TLR4抑制剂TAK-242预处理U937细胞,抗菌肽进入细胞的数量明显减少,提示部分抗菌肽可以随着TLR4的内化而进入细胞。抗菌肽内化量与其抗炎活性有直接关系:U937细胞经LPS预处理后,抗菌肽对炎症因子TNF-α、IL-6和趋化因子MCP-1、MIP-1的抑制率占正常处理组的70%,这也建议抗菌肽是通过细胞内受体抑制炎症因子的释放。进一步实验用抗菌肽L-K6、L-K5、L-K6V1和L-K6V2预处理U93细胞,使抗菌肽在LPS诱导炎症反应之前进入细胞,发现同样可以抑制炎症反应,但抑制率仅为正常组的75%,进一步说明四种抗菌肽除了能够在细胞外中和LPS,同时更主要是在细胞内发挥其抗炎作用。