基于ER途径探讨左归丸含药血清对破骨细胞分化和破骨相关炎症因子的影响

来源 :辽宁中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:paokahh
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目的:本研究基于原发性骨质疏松症患者肾精亏虚,骨枯髓减的中医辨证分型特点,选用补肾滋阴,填精益髓经典方剂左归丸,探讨左归丸含药血清对RANKL诱导小鼠破骨细胞分化和破骨相关炎症因子及ER途径对其影响,揭示其抑制骨吸收的作用机制,为左归丸抗原发性骨质疏松症提供实验依据。材料与方法:1.SPF级雄性SD大鼠35只(240270 g),适应性饲养7 d后,根据体质量随机分为5组,分别为空白对照组、左归丸低剂量组、左归丸中剂量组、左归丸高剂量组和补佳乐组,7只/组。按照人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠左归丸低、中、高剂量等临床剂量分别为4.84 g·kg-1、9.68 g·kg-1、19.36 g·kg-1,大鼠补佳乐等临床剂量为0.09 mg·kg-1,空白对照组给予生理盐水,灌服10 ml·kg-1,1次·d-1,连续灌胃7d,取材前2 h进行末次给药,腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉取血。放置于室温2 h,4℃、2500rpm·min-1,离心20 min,收集同组血清,56℃灭活30 min,制备大鼠含药血清。2.运用不同浓度(25、50、100 ng·ml-1)转录因子NF-κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导小鼠RAW264.7细胞3、5、7 d,分化为破骨细胞。对破骨细胞进行鉴定,抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察破骨细胞阳性细胞数;实时荧光定量PCR法检测抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)mRNA表达。3.不同浓度(5、10、15、20%)左归丸含药血清干预RANKL诱导小鼠破骨细胞24、48、72 h后,MTT法检测破骨细胞增殖;TRAP染色法观察破骨细胞阳性细胞数,实时荧光定量PCR法检测TRACP、RANKL、活化T细胞核因子1(Nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATC1)mRNA表达水平观察破骨分化;AO/EB染色法观察破骨细胞凋亡;ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素(Interleukin,IL)-10和IL-17含量。4.采用雌激素受体(ER)抑制剂ICI 182780与10%浓度左归丸含药血清共同孵育48 h。TRAP染色法观察破骨细胞阳性细胞数,Western blot法检测IL-6、IL-10、白细胞介素-10受体A(Interleukin-10 receptor A,IL-10RA)、CX3C趋化因子受体1(CX3C chemokin receptor 1,CX3CR1)、CX3C趋化因子1(CX3C chemokin 1,CX3CL1)蛋白表达。结果:1.破骨细胞诱导与鉴定TRAP染色结果显示,RANKL诱导5 d和7 d时,RANKL干预各组可见TRAP阳性细胞,出现多个细胞核融合现象,细胞质内含有大量紫红色颗粒,且阳性区域面积与RANKL浓度成正比。RANKL诱导5 d,浓度为50 ng·ml-1及100 ng·ml-1,与RANKL诱导7 d,浓度为100 ng·ml-1时,实时荧光定量PCR结果显示以上各组TRACP mRNA表达均显著增加(P<0.01)。2.左归丸含药血清对破骨细胞增殖、分化、凋亡及破骨相关炎症因子的影响MTT结果显示,10%左归丸中、高剂量含药血清干预48 h后,破骨细胞增殖能力显著减弱(P<0.01)。TRAP染色结果显示,左归丸中、高剂量组TRAP阳性细胞数量减少,细胞形态多呈现较为规则的单核细胞。实时荧光定量PCR结果显示,左归丸中剂量组可显著下调破骨细胞TRACP、RANKL、NFATC1 mRNA含量(P<0.01)。AO/EB染色结果显示,RANKL组细胞荧光呈绿色和橙红色相间;与RANKL组比较,左归丸中剂量组被溴化乙锭标记的橙红色荧光明显增多。ELISA法结果显示,左归丸低、中、高剂量组可上调破骨细胞上清液中IL-10含量(P<0.05),其中中剂量组效果更显著(P<0.01);中、高剂量组可显著下调IL-17含量,并且两组间无显著差异(P>0.05)。3.左归丸含药血清通过ER途径调控破骨细胞分化和破骨相关炎症因子TRAP染色结果显示,经ICI 182780处理,与左归丸组比较,左归丸+ICI 182780组TRAP阳性细胞数量增加。Western blot法结果显示,与左归丸组比较,左归丸+ICI182780组IL-6蛋白表达显著增加(P<0.01),IL-10蛋白表达减少(P<0.05),IL-10RA蛋白表达增加(P<0.05),CX3CR1蛋白表达显著增加(P<0.01)。结论:1.左归丸含药血清可抑制RANKL诱导的破骨细胞增殖分化,促进破骨细胞凋亡,有效增加抑炎细胞因子和减少促炎细胞因子含量。2.左归丸含药血清可能部分通过ER途径调节破骨相关炎症因子以抑制破骨细胞的分化,进而抑制骨吸收功能。
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