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目的:本研究基于原发性骨质疏松症患者肾精亏虚,骨枯髓减的中医辨证分型特点,选用补肾滋阴,填精益髓经典方剂左归丸,探讨左归丸含药血清对RANKL诱导小鼠破骨细胞分化和破骨相关炎症因子及ER途径对其影响,揭示其抑制骨吸收的作用机制,为左归丸抗原发性骨质疏松症提供实验依据。材料与方法:1.SPF级雄性SD大鼠35只(240270 g),适应性饲养7 d后,根据体质量随机分为5组,分别为空白对照组、左归丸低剂量组、左归丸中剂量组、左归丸高剂量组和补佳乐组,7只/组。按照人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠左归丸低、中、高剂量等临床剂量分别为4.84 g·kg-1、9.68 g·kg-1、19.36 g·kg-1,大鼠补佳乐等临床剂量为0.09 mg·kg-1,空白对照组给予生理盐水,灌服10 ml·kg-1,1次·d-1,连续灌胃7d,取材前2 h进行末次给药,腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉取血。放置于室温2 h,4℃、2500rpm·min-1,离心20 min,收集同组血清,56℃灭活30 min,制备大鼠含药血清。2.运用不同浓度(25、50、100 ng·ml-1)转录因子NF-κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导小鼠RAW264.7细胞3、5、7 d,分化为破骨细胞。对破骨细胞进行鉴定,抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察破骨细胞阳性细胞数;实时荧光定量PCR法检测抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)mRNA表达。3.不同浓度(5、10、15、20%)左归丸含药血清干预RANKL诱导小鼠破骨细胞24、48、72 h后,MTT法检测破骨细胞增殖;TRAP染色法观察破骨细胞阳性细胞数,实时荧光定量PCR法检测TRACP、RANKL、活化T细胞核因子1(Nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATC1)mRNA表达水平观察破骨分化;AO/EB染色法观察破骨细胞凋亡;ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素(Interleukin,IL)-10和IL-17含量。4.采用雌激素受体(ER)抑制剂ICI 182780与10%浓度左归丸含药血清共同孵育48 h。TRAP染色法观察破骨细胞阳性细胞数,Western blot法检测IL-6、IL-10、白细胞介素-10受体A(Interleukin-10 receptor A,IL-10RA)、CX3C趋化因子受体1(CX3C chemokin receptor 1,CX3CR1)、CX3C趋化因子1(CX3C chemokin 1,CX3CL1)蛋白表达。结果:1.破骨细胞诱导与鉴定TRAP染色结果显示,RANKL诱导5 d和7 d时,RANKL干预各组可见TRAP阳性细胞,出现多个细胞核融合现象,细胞质内含有大量紫红色颗粒,且阳性区域面积与RANKL浓度成正比。RANKL诱导5 d,浓度为50 ng·ml-1及100 ng·ml-1,与RANKL诱导7 d,浓度为100 ng·ml-1时,实时荧光定量PCR结果显示以上各组TRACP mRNA表达均显著增加(P<0.01)。2.左归丸含药血清对破骨细胞增殖、分化、凋亡及破骨相关炎症因子的影响MTT结果显示,10%左归丸中、高剂量含药血清干预48 h后,破骨细胞增殖能力显著减弱(P<0.01)。TRAP染色结果显示,左归丸中、高剂量组TRAP阳性细胞数量减少,细胞形态多呈现较为规则的单核细胞。实时荧光定量PCR结果显示,左归丸中剂量组可显著下调破骨细胞TRACP、RANKL、NFATC1 mRNA含量(P<0.01)。AO/EB染色结果显示,RANKL组细胞荧光呈绿色和橙红色相间;与RANKL组比较,左归丸中剂量组被溴化乙锭标记的橙红色荧光明显增多。ELISA法结果显示,左归丸低、中、高剂量组可上调破骨细胞上清液中IL-10含量(P<0.05),其中中剂量组效果更显著(P<0.01);中、高剂量组可显著下调IL-17含量,并且两组间无显著差异(P>0.05)。3.左归丸含药血清通过ER途径调控破骨细胞分化和破骨相关炎症因子TRAP染色结果显示,经ICI 182780处理,与左归丸组比较,左归丸+ICI 182780组TRAP阳性细胞数量增加。Western blot法结果显示,与左归丸组比较,左归丸+ICI182780组IL-6蛋白表达显著增加(P<0.01),IL-10蛋白表达减少(P<0.05),IL-10RA蛋白表达增加(P<0.05),CX3CR1蛋白表达显著增加(P<0.01)。结论:1.左归丸含药血清可抑制RANKL诱导的破骨细胞增殖分化,促进破骨细胞凋亡,有效增加抑炎细胞因子和减少促炎细胞因子含量。2.左归丸含药血清可能部分通过ER途径调节破骨相关炎症因子以抑制破骨细胞的分化,进而抑制骨吸收功能。